Estudo do bagaço de azeitona produzido em sistemas de extracção de azeite de duas fases: caracterização química e reológica dos polissacarídeos pécticos e análise estrutural dos compostos fenólicos

Abstract

O objectivo principal deste trabalho foi o estudo dos polissacarídeos pécticos e dos compostos fenólicos obtidos a partir do bagaço de azeitona produzido em sistemas de extracção de azeite de duas fases, contribuindo para a valorização deste resíduo. Numa primeira fase do trabalho, os polissacarídeos pécticos foram extraídos sequencialmente com água e solução 0,02 mol/L de HNO3 a 80°C, a partir do material das paredes celulares. O fraccionamento dos extractos mais ricos em açúcares, efectuado por precipitação em etanol seguido de cromatografia de troca iónica e de exclusão em gel permitiu concluir que o material péctico em cada extracto era muito disperso em relação à sua carga e à sua massa molecular. Através do procedimento de fraccionamento foi possível isolar uma fracção representativa das cadeias laterais de arabinanas dos polissacarídeos pécticos do bagaço de azeitona, e a sua análise de metilação e espectrometria de RMN permitiram sugerir uma estrutura peculiar para estes polímeros. O estudo de RMN foi também efectuado numa fracção representativa das cadeias principais de polissacarídeos pécticos, tendo sido possível a confirmação de algumas das propriedades estruturais gerais descritas para estes polissacarídeos. Tendo em vista uma possível aplicação industrial dos polissacarídeos pécticos do bagaço de azeitona, a extracção destes polissacarídeos foi posteriormente efectuada a partir do AIR com solução 0,02 mol/L de HNO3 a 80°C durante 2h, seguida de precipitação em etanol, um método mais aproximado daquele utilizado industrialmente para obtenção de pectinas de maçã e de citrinos. Este método de extracção foi aplicado em amostras provenientes do mesmo lote de azeitonas, mas colhidas em diferentes fases do procedimento de extracção de azeite, de forma a avaliar se esses procedimentos eram responsáveis por alterações significativas na estrutura dos polissacarídeos pécticos obtidos. A quantidade de ácido urónico e a composição de açúcares dos extractos pécticos mais representativos foi semelhante para as várias amostras, indicando que a quantidade e a estrutura de material péctico obtido por extracção acídica a quente não é afectada pelos processos a que a azeitona é sujeita durante a produção do azeite. A extracção de material péctico de amostras de bagaço de azeitona de duas variedades distintas e/ou com diferentes tempos de armazenamento, efectuada pelo mesmo método, permitiu ainda concluir que aqueles factores não afectam significativamente a razão Ara/AcUr na estrutura do material péctico solubilizado pelo ácido, muito embora o seu índice de metilesterificação seja heterogéneo. Como tentativa de maior aproximação estrutural dos polissacarídeos pécticos extraídos do bagaço de azeitona daqueles normalmente obtidos de outras fontes ao nível industrial, a remoção das cadeias laterais de arabinanas dos polissacarídeos pécticos de um dos extractos pécticos do bagaço de azeitona foi testada enzimaticamente por utilização simultânea de endo-arabinanase e de α-L-arabinofuranosidase. Este tratamento resultou numa diminuição próxima de 90% dos conteúdos de Ara na amostra, originando um extracto muito rico em ácido urónico. A purificação de uma fracção representativa do material péctico obtido de bagaço de azeitona, efectuada com solução de EDTA (2,5%, m/m) IV seguida de percolação através de um trocador iónico forte, resultou numa redução de aproximadamente 90% do seu conteúdo em cinzas, originando um extracto péctico em que o cálcio representava apenas 0,03% (m/m). O extracto péctico purificado, caracterizado por um baixo índice de metilesterificação, foi usado no estudo reológico de géis de pectina-cálcio. Este extracto formou géis por adição de cálcio, a pH 7 e 3, com uma cinética de maturação semelhante à descrita para géis de pectinas e de outros biopolímeros. Para ambos os valores de pH, verificou-se um aumento do módulo elástico dos géis de pectina-cálcio por aumento da concentração de polímero ou de cálcio. Os géis de pectina-cálcio exibiram propriedades térmicas peculiares, sugerindo que o seu mecanismo de gelificação poderá apresentar diferenças relativamente ao descrito para as pectinas de baixo índice de metilesterificação. Os compostos fenólicos do bagaço de azeitona e da polpa de azeitona foram na sua maioria solubilizados por metanol. A análise da principal fracção purificada do extracto de metanol, efectuada por HPLC e por espectrometria de massa, permitiu identificar 13 compostos fenólicos já descritos para a O. europaea. Esta análise permitiu também fazer a identificação de dois derivados de oleosídeo, o 6´-(1-β-glucopiranosil)- oleosídeo e o 6´-(1-β-ramnopiranosil)-oleosídeo, e a 10-hidroxi-oleuropeína, que foram identificados pela primeira vez em tecidos da O. europaea. Ainda foi possível detectar um hexosídeo de oleuropeína, o angustifoliosídeo A, que foi anteriormente referido em folhas de oliveira e agora detectado, pela primeira vez, no seu fruto. Os compostos identificados nas amostras de bagaço e de polpa de azeitona foram os mesmos. No entanto, o bagaço apresentou conteúdos de oleuropeína e de oleosídeo muito baixos em relação à polpa, sugerindo a modificação destes compostos durante o processo de extracção de azeite. Uma fracção minoritária de compostos fenólicos, solubilizada quer a partir do bagaço quer da polpa por solução aquosa de acetona, e purificada, revelou a presença de oligómeros de oleuropeína, nunca referidos na literatura. A análise desta fracção por RMN e por espectrometria de massa permitiu sugerir que estes compostos eram trímeros de oleuropeína, cujas unidades monoméricas se encontram ligadas entre si através da parte fenólica da molécula, com um número variável de ligações.

The main aim of this work was the study of pectic polysaccharides and of phenolic compounds obtained from the olive pomace originated in the olive oil production by a biphasic system, as a contribution for its valorisation. In a first stage, the pectic polysaccharides were sequentially extracted from the cell wall material by water and HNO3 0.02 mol/L at 80°C. The fractionation of the main sugar extracts, by ethanol precipitation followed by ionic and gel exclusion chromatographies, showed that the pectic polysaccharides in each extract were very heterogeneous concerning to their charge and to their molecular weight. The fractionation procedure also enabled the isolation of a representative arabinan fraction, typical from the pectic polysaccharides side chains of olive pomace. Its methylation analysis and NMR study allowed to suggest a peculiar structure for those polymers. NMR analysis was also useful for the confirmation of some general properties in a representative fraction of the pectic main chain. Subsequently, the pectic polysaccharides were obtained from the AIR, by extraction with HNO3 0.02 mol/L at 80°C for 2h, followed by ethanol precipitation, that is a similar method to the one used for the extraction of apple and citric commercial pectins. This procedure was performed in four different samples from the same batch of olives, but submitted to distinct processes involved in the olive oil production. The uronic acid content and the sugar composition of the most representative pectic extract was similar for the various samples, showing that the amount of acid solubilized pectic polysaccharides and their structure were not affected by the olives treatments during the olive oil production. The same method of pectic extraction was applied to different samples of olive pomace, originated from distinct olive varieties and/or stored for different periods before using. The comparison of the sugar composition of the pectic extracts also indicated similar structure polysaccharides but with a heterogeneous degree of methylesterification. As a tentative to approach the structural characteristics of the pectic polysaccharides of olive pomace to those of commercial pectins, the removal of the arabinan side chains from pectic polysaccharides was tested by the enzymatic treatment of a representative olive pomace pectic extract with endo-arabinanse and α-L-arabinofuranosidase. By this treatment, the quantity of arabinose was decreased by 90%, originating an uronic acid rich fraction. A representative olive pomace pectic extract was purified by EDTA (2.5%, w/w) followed by percolation through a strong ionic changer. This treatment originated a 90% decrease of its ash content and calcium accounted only for 0.03% (w/w) of the fraction. The purified pectic extract, characterised by a low degree of methylesterifcation, was used for gelation studies in pectin-calcium systems. The results showed that, this pectic extract formed gels on addition of calcium, at pH 7 and 3, with a kinetic of formation similar to that one described for pectins and for other biopolymers. For both pH, higher values of the elastic modulus were obtained when rising the polymer or the calcium concentrations. These gels exhibit peculiar thermal properties, suggesting the existence of a crosslink mechanism far from the classical model described for the gelation of the low methylesterification pectins. The phenolic compounds of olive pomace and olive pulp were mostly solubilized by methanol. The analysis of the main methanolic purified fraction, by HPLC and mass spectrometry, allowed the identification of 13 phenolic compounds already described in O. europaea. Moreover, it enabled the identification, for the first time in O. europaea tissues, of two oleoside derivatives, 6´-(1-β-glucopyranosyl)-oleoside and 6´-(1-β-rhamnopyranosyl)- oleoside, and of 10-hydroxy-oleuropein. Also, an oleuropein glucoside, the angustifolioside A, that as been previously referred in olive leaves was now detected in the olive fruit. The identified phenolic compounds were the same for the olive pomace and olive pulp. However, the oleoside and oleuropein contents were very diminished in the olive pomace with respect to the olive pulp, suggesting their modification during the olive oil extraction process. A minor phenolic fraction, extracted from olive pomace and olive pulp by aqueous acetone, and purified, was mainly composed of oleuropein oligomers. Its NMR and mass spectrometry analysis allowed to suggest that those compounds were oleuropein trimmers, probably linked by the phenolic part of the molecule by a variable number of linkages.