Evaluation of circulating endothelial progenitor cells by multicolor flow cytometry in chronic kidney disease patients

Abstract

Endothelial dysfunction and impaired endothelial regenerative capacity play a key role in the pathogenesis of cardiovascular disease, which is one of the major causes of mortality in chronic kidney disease (CKD) patients. Circulating endothelial cells (CEC) may be an indicator of vascular damage, while circulating endothelial progenitor cells (EPC) may be a biomarker for vascular repair. However, the simultaneously evaluation of CEC and EPC circulating levels and its relation were not previously examined in CKD population. A blood sample (18ml) of healthy subjects (n=10), early CKD (n=10) and advanced CKD patients (n=10) was used for the isolation of early and late EPCs, CECs, and hematopoietic cells, identified by flow cytometry (BD FACSCanto™ II system) using a combination of fluorochrome-conjugated primary antibodies: CD31-PE, CD45-APC Cy7, CD34-FITC, CD117-PerCp Cy5.5, CD133-APC, CD146-Pacific Blue, and CD309-PECy7. Exclusion of dead cells was done according to a fixable viability dye staining. This eightcolor staining flow cytometry optimized protocol allowed us to accurate simultaneously identify EPCs, CECs and hematopoietic cells. In addition, it was also possible to distinguish the two subpopulations of EPCs, early and late EPCs subpopulation, by CD45intCD31+CD34+CD117-CD133+CD309-CD146- and CD45intCD31+CD34+CD117-CD133-CD309+CD146- multiple labeling, respectively. Moreover, the identification of CECs and hematopoietic cells was performed by CD45-CD31+CD34-/lowCD117-CD133-CD309-CD146+ and CD34+CD117+, respectively. The levels of CECs were non-significantly increased in early CKD (312.06 ± 91.34) and advanced CKD patients (191.43±49.86) in comparison with control group (103.23±24.13). By contrast, the levels of circulating early EPCs were significantly reduced in advanced CKD population (17.03±3.23) in comparison with early CKD (32.31±4.97), p=0.04 and control group (36.25 ± 6.16), p=0.03. In addition the levels of late EPCs were significantly reduced in both advanced (6.60±1.89), p=0.01, and early CKD groups (8.42±2.58), p=0.01 compared with control group (91.54±29.06). These results were accompanied by a dramatically reduction in the recruitment, differentiation and regenerative capacity indexes in CKD population. Taken together, these results suggest an imbalance in the process of endothelial repairment in CKD population, and further propose that the indexes of recruitment, differentiation and regenerative capacity of EPCs, may help to select the patients to benefit from guiding intervention strategies to improve cardiovascular health by inducing vascular protection.

A disfunção endotelial e as alterações nos processos de regeneração endotelial podem desempenhar um papel determinante na patogénese da doença cardiovascular, que é uma das principais causas de mortalidade na doença renal crónica (DRC). As células endoteliais circulantes (CEC) podem ser um indicador de dano vascular, enquanto que as células progenitoras endoteliais circulantes (CPEC) pode ser um biomarcador de reparação vascular. No entanto, a avaliação simultânea dos níveis de CECs e de CPECs e sua relação não foram previamente avaliados numa população de doentes renais crónicos. Amostras de sangue (18 mL) foram recolhidas a partir de indivíduos saudáveis (n = 10), e a partir de doentes renais crónicos em estadios precoces (n=10) e em estádios avançados (n=10), para se proceder ao isolamento de populações de CPECs imaturas e maduras, CECs e células hematopoiéticas. Estas populações de células foram identificadas por citometria de fluxo (sistema BD FACS Canto II) usando uma combinação de anticorpos primários conjugados com fluorocromos: CD31-PE, CD45-APC Cy7, CD34-FITC, CD117-PerCp Cy5.5, CD133-APC, CD309-PE Cy7 e CD146-Paciific blue. Para a exclusão das células mortas recorreu-se a um marcador de viabilidade (“fixable viability dye”). Este protocolo otimizado de citometria de fluxo de oito cores permitiu identificar simultaneamente e com precisão as subpopulações de CECs, CPECs e células hematopoiéticas. Além disso, também foi possível distinguir as duas subpopulações de CPECs, imaturas e maduras, por marcação múltipla CD45intCD31+ CD34+ CD117-CD133+ CD309-CD146- e CD45intCD31+ CD34+CD117- CD133-CD309+ CD146-, respetivamente. Adicionalmente, a identificação de CECs e células hematopoiéticas foi realizada por CD45-CD31+ CD34-/lowCD117- CD133-CD309- CD146+ e CD34+ CD117+, respetivamente. Os níveis de CECs foram mais elevados em pacientes em estadios precoces de DRC (312,1±91,3) e em estadios avançados (191,4±49,9) comparativamente com o grupo controlo (103,23±24,13), n.s. Para além disso, os níveis de CPECs imaturas foram significativamente diminuídos em estadios avançados de DRC (17,1±3,2) em comparação com estadios precoces (32,3±4,9), p=0,04, e com o grupo controlo (36,3±6,2), p=0,03. Os níveis de CPECs maduras foram significativamente reduzidos em estadios avançados de DRC (6,6±1,9), p=0,01 e em estadios precoces (8,4±2,6), p=0,01, em comparação com o grupo controlo (91,5±29,1). Estes resultados foram acompanhados por uma diminuição acentuada nos índices de capacidade de recrutamento, diferenciação e regeneração na população de doentes renais crónicos. Globalmente, estes resultados sugerem um desequilíbrio no processo de reparação endotelial na DRC, e sugerem ainda, que os índices de recrutamento, diferenciação e regeneração podem ajudar na seleção de pacientes que possam beneficiar de estratégias de intervenção para melhorar a saúde cardiovascular induzindo proteção vascular.