Study of the cell surface proteome for the analysis of Parkinson’s disease associated DJ-1 mutations

Abstract

Parkinson’s disease (PD) is a neurodegenerative disease, characterized with selective neurodegeneration and dopamine depletion. Despite most cases appear to have sporadic origin, it has been associated various monogenic mutations to the onset of a parkinsonian phenotype. DJ-1 protein is of particular interest given its neuroprotective role against oxidative stress and mitochondria impairment, and the identification of several mutations correlated with early onset PD. For this study, it were then produced two pathological mutations of DJ-1, M26I and E163K. SDS-PAGE and LC-MS/MS analysis confirmed the adequate production and purification of the both mutant proteins, and SEC-HPLC secured the structural perseverance of the mutations as homodimers, a key feature of DJ-1 essential for its biological activity. On the other hand, SH-SY5Y viability assays indicated that despite the native form protective role against oxidative stress, M26I and E163K mutations showed a compromised neuroprotective capacity. To better understand the reasons for this biological impairment, it was developed a protocol for cell surface proteins labelling with Sulfo-NHSLC-biotin and avidin pull-down for enrichment and downstream MS analysis. Assays such as western blotting, LC-MS/MS and confocal microscopy confirmed the adequacy of the proposed procedure. When applied for the analysis of proteome variations related to oxidative stress, in enriched fractions from SH-SY5Y biotinylation and avidin pull-down of crude membrane sub cellular part, it allowed the identification of several proteins of interest, namely four proteins with significant difference caused by oxidative stress induction, and of other proteins of interest. It was also performed the direct pull-down of whole protein extract, offering inconclusive results regarding the preferential use of ultracentrifugation before pull-down. Nevertheless, it was the first time that SH-SY5Y cell surface was analysed in a PD context, and it could be used in the future to study cell surface proteome alterations modulated by oxidative stress and extracellular presence of native or mutant DJ-1, providing new insights regarding its intake and signalling modulation in pathological conditions, and hence contributing for a new perspective over preventive or eliciting mechanisms associated to the onset of Parkinson’s disease.

A doença de Parkinson é uma doença neurodegenerativa caracterizada por uma neurodegeneração selectiva e depleção de dopamina, e apesar de grande parte dos casos terem origem esporádica diversas mutações monogénicas têm sido associadas ao desenvolvimento de um fenótipo parkinsoniano. A proteína DJ-1 é de particular interesse, dado o seu papel neuroprotector contra stress oxidativo e disfunção mitocondrial, e a identificação de mutações correlacionadas a doença de Parkinson precoce. Neste estudo, foram produzidas duas mutações patológicas da proteína DJ-1, M26I e E163K. Uma análise SDS-PAGE e LC-MS/MS comprovou uma produção e purificação adequada das mutações, e SEC-HPLC assegurou a preservação estrutural das mutações de DJ-1 como homodímeros, uma característica chave de DJ-1 fundamental para a sua actividade biológica. Por outro lado, estudos de viabilidade de SH-SY5Y indicaram que, apesar do papel protector da forma nativa contra stress oxidativo, as mutações M26I e E163K demonstraram uma reduzida capacidade neuroprotectiva. Para melhor compreender os motivos desta disfunção biológica, foi desenvolvido um protocolo para marcação das proteínas de superfície celular com Sulfo-NHS-LC-biotina e pull-down com avidina para enriquecimento e subsequente análise MS. Vários ensaios como western blotting, LC-MS/MS e microscopia confocal confirmaram a adequação do protocolo sugerido. Quando aplicado para uma análise de variações proteómicas relacionadas com stress oxidativo, em fracções enriquecidas provenientes da biotinilação de SH-SY5Y e pull-down da parte membranar do extracto celular, permitiu a identificação de várias proteínas de interesse, nomeadamente quatro proteínas com diferença significativa resultante da indução de stress oxidativo. Também foi realizado um pull-down com a totalidade extracto celular, que resultou em dados não conclusivos relativamente ao uso de ultracentrifugação antes do pull-down. Não obstante, este estudo correspondeu à primeira análise da superfície celular de SH-SY5Y realizada num contexto da doença de Parkinson, que poderá ser usada no futuro para estudar alterações no proteoma de superfície celular em ambiente de stress oxidativo e de adição da proteína DJ-1, na forma nativa e mutante, de forma a fornecer novas pistas referentes ao seu intake e modulação da sinalização em ambiente oxidativo, e em suma contribuindo para uma nova perspectica sobre os mecanismos protectores ou despoletadores da doença de Parkinson.