Characterization of the genes determining pollen specificity in self-incompatibility mechanism of Malus x domestica

Abstract

To understand the molecular basis of the S-RNase-based gametophytic selfincompability system of subtribe Pyrinae from Rosaceae family, in this work, Malus x domestica species was used to determine the genes involved in pollen S-specificity. Previously 18 F-box genes, similar to the S-locus F-box brothers (SFBBs), were identified by conventional polymerase chain reaction techniques and with the pollen transcriptome analysis of nine M. domestica cultivars. However, not all 10 S-haplotypes, covered by the nine M. domestica cultivars used, have been characterized for all SFBB genes, and 12 SFBB sequences found, align as highly divergent sequences in 12 SFBB genes. Thus, in this work, by cloning and sequencing analysis of two highly diverged alleles, namely, SFBBGu8 and SFBBN3 of SFBB5 and SFBB1 genes, respectively, was concluded that SFBBGu8 sequence represent the S1- and S24- diverged alleles of SFBB5 gene, while SFBBN3 sequence represent the S28- diverged allele of SFBB1 gene. Additionally, for SFBB5 gene there is no SFBB copy number variation. This pattern was also observed for other 12 SFBB genes. For 15 of the 18 SFBB genes identified, linkage with the S-RNase gene (gene involved in pistil S-specificity) was established by segregation analysis of the F1 progeny from the cross of Fuji (S1, S9) with Honeycrisp (S2, S24), previously genotyped. As result, for SFBB2, SFBB3, SFBB4, SFBB6, SFBB7, SFBB8, SFBB9, SFBB10, SFBB11, SFBB12, SFBB13, SFBB14 and SFBB16 genes, linkage with at least one S-RNase allele was established. Thus, since these 13 SFBB genes also present pollen-specific expression and S-haplotypespecific polymorphism, these genes are pollen S-genes. In conclusion, consistent features with the collaborative non-self recognition model, were identified in M. domestica species, such as, large number of SFBB genes and the presence of highly diverged SFBB alleles, that may be conserved in other S-haplotypes, and thus, involved in the recognition of a particular non-self S-RNase. However, in M. domestica species, it was not verified SFBB copy number variation within the different S-haplotypes, as observed in Petunia. The characterization of the S-pollen genes involved in the self-incompatibility mechanism in M. domestica species is the first step to characterize self-pollen rejection mechanism in Pyrinae subtribe.

Para compreender a base molecular do sistema de auto-incompatibilidade gametofítica baseada em S-RNases da subtribo Pyrinae da família Rosaceae, neste trabalho, a espécie Malus x domestica foi utilizada para determinar os genes envolvidos na especificidade S do pólen. Previamente 18 genes F-box, semelhantes aos “S-locus F-box brothers” (SFBBs), foram identificados por uma abordagem baseada em técnicas convencionais de reação em cadeia da polimerase e por análise de transcriptomas do pólen de nove cultivares de M. domestica. Contudo, nem todos os 10 haplótipos S, cobertos pelos nove cultivares de M. domestica utilizados, foram caracterizados para todos os genes SFBB, e 12 sequências SFBB encontradas, alinham como sequências altamente divergentes em 12 genes SFBB. Assim, neste trabalho, por clonagem e sequenciação de dois alelos altamente divergentes, nomeadamente, SFBBGu8 e SFBBN3 dos genes SFBB5 e SFBB1, respectivamente, concluiu-se que a sequência SFBBGu8 representa os alelos divergentes S1- e S24- do gene SFBB5, enquanto que a sequência SFBBN3 representa o alelo divergente S28- do gene SFBB1. Adicionalmente, para o gene SFBB5 não existe variação do número de cópias dos SFBBs. Este padrão foi também observado para outros 12 genes SFBB. Para 15 dos 18 genes SFBB identificados, foi determinada associação com o gene da SRNase (gene envolvido na especificidade S do pistilo) através de análises de segregação da progenia F1 resultante do cruzamento de Fuji (S1, S9) com Honeycrisp (S2, S24), previamente genotipada. Como resultado, para os genes SFBB2, SFBB3, SFBB4, SFBB6, SFBB7, SFBB8, SFBB9, SFBB10, SFBB11, SFBB12, SFBB13, SFBB14 e SFBB16, foi estabelecida associação com pelo menos um alelo da S-RNase. Assim, dado que estes 13 genes SFBB também apresentam expressão exclusiva no pólen e polimorfismo específico para cada haplótipo S, estes genes são genes S do pólen. Em conclusão, foram identificadas características consistentes com o modelo “collaborative non-self-recognition” em M. domestica, tais como, um grande número de genes SFBB e a presença de alelos SFBB altamente divergentes, que podem ser conservados noutros haplótipos S e assim, estar envolvidos no reconhecimento de uma S-RNase não-própria. Contudo, em M. domestica, não ser verificou variação do número de cópias dos SFBBs nos diferentes haplótipos S, como observado em Petunia. A caraterização dos genes S do pólen envolvidos no mecanismo de auto-incompatibilidade em M. domestica é o primeiro passo para caracterizar o mecanismo de rejeição do pólen do próprio, na subtribo Pyrinae.