Determinação de parâmetros cinéticos da cardosina A em presença de ureia

Abstract

A Cynara cardunculus L. é tradicionalmente usada em Portugal na produção dos queijos Serra, Azeitão e Serpa. A capacidade que apresenta para coagular o leite deve-se à presença de três hidrolases da classe das proteinases aspárticas, cardosina A, B e Ao, sendo a primeira a mais abundante, melhor caracterizada e sobre a qual incide este trabalho. A cardosina A pode apresentar-se como uma alternativa à tripsina na digestão de proteínas hidrófobas, no entanto, estas proteínas são pouco solúveis em meio aquoso pelo que o primeiro passo deve ser aumentar a sua solubilidade. A ureia funciona como agente solubilizante das proteínas ao aumentar a sua solubilidade em solução, mas, dependendo da concentração usada, é também um agente desnaturante. O objectivo deste trabalho consiste em estudar a influência da ureia na cardosina A, através da determinação de parâmetros cinéticos da enzima. A cardosina A foi extraída da planta do cardo através de extracção acídica, seguida de purificação em dois passos, cromatografia de exclusão molecular e de troca iónica. A determinação dos parâmetros cinéticos da cardosina A realizou-se por espectrofotometria de Ultra Violeta a 300 nm usando como substrato um octapéptido sintético, Lys-Pro-Ala-Glu-Phe-Phe(NO2)-Ala-Leu, que contém um grupo cromóforo. A concentração de ureia variou entre 0,0 e 3,0 M e as constantes cinéticas foram calculadas segundo os métodos de linearização de Lineweaver-Burk, Hanes -Woolf e Eisenthal-Cornish-Bowden, sendo o primeiro o método mais popular, e o último, segundo diferentes autores, o que melhores estimativas faz das constantes. Verificou-se que em presença de ureia, as constantes de Michaelis-Menten (Km), catalítica (Kcat) e de eficiência catalítica (Kcat/Km) aumentam. A titulação dos locais activos da cardosina A revelou que a concentração de enzima activa diminui consideravelmente com a concentração de ureia, verificando-se que a 2,5 M e a 3,0 M apenas 5,0 e 2,7% da enzima, respectivamente, permanece activa. Os dados obtidos da titulação em conjunto com as constantes cinéticas determinadas indicam que até 3,0 M ureia, apesar de ocorrer desnaturação de uma fracção importante da cardosina A, a enzima que continua activa apresenta uma maior eficiência catalítica. Estes dados são indicativos de modificações na conformação nativa do local activo da enzima e estruturas adjacentes importantes para a catálise, modificações estas que, até 3,0 M ureia, contribuem para um aumento efectivo do desempenho catalítico da enzima.

In Portugal, Cynara cardunculus L. is commonly used in the cheese industry. “Serra”, “Azeitão” and “Serpa”, cheese makers utilize this plant as the main source of milk clothing enzymes. Cynara cardunculus ability to induce milk clothing is due to the activity of three types of aspartic proteases: cardosin A, B and A0. This dissertation focuses on the study of cardosin A, the most abundant and best characterized protease of the three. Cardosin A may be a good alternative to tripsyn in digestion of hydrophobic proteins. However these proteins have low solubility in aqueous solutions and require a solubilizing agent, such as urea. Urea increases the protein solubility but, depending on its concentration, it is also a denaturant and therefore can render cardosin A inactive. The goal of this work is to determine the influence of urea on cardosin A kinetic parameters. Cardosin A was purified from Cynara pistils through a 3-step protocol: acidic extration followed by exclusion chromatografhy and ionic exchange chromatography. Cardosin A’s kinetic parameters in the absence/presence of urea were studied by UV spectrophotometry at 300nm, using the chromogenic synthetic octapeptide Lys-Pro-Ala-Glu-Phe-Phe(NO2)-Ala-Leu. The urea concentration tested varied from 0,4 e 3,0 M and the kinetic constants were calculated according to the methods described by Lineweaver-Burk, Hanes-Woolf and Eisenthal-Cornish-Bowden. Lineweaver-Burk’s method is the most commonly used in the literature but Eisenthal-Cornish-Bowden’s method is, according to various sources, the most accurate. We determined that cardosin A’s Michaelis-Menten (Km), catalytic (Kcat) and catalytic efficiency (Kcat/Km) constants increase with urea concentration. The titration of cardosin A’s active sites revealed that incubation with progressively higher concentrations of urea leads to a reduction in the concentration of active enzyme; for instance, at 3,0 M of urea, only 2.7% of cardosin A remains active. Interestingly, the kinetic parameters indicate that up to 3,0 M urea, the proportion of cardosin A that remains active has as higher catalytic efficiency. Taken together, the data presented in this study suggest that urea induces modifications in the conformation of cardosin A’s active site and in adjacent structures also involved in the catalysis and that these modifications are responsible for the increased catalytic efficiency of the enzyme.