Estudo molecular de microcitoses hereditárias com hemoglobina A2 normal

Abstract

Num indivíduo, a observação de parâmetros hematológicos com hipocromia e microcitose com níveis normais de Hb Ag, após exclusão de deficiência de ferro (sideropenia), pode ser devida a uma alteração quantitativa ou qualitativa na síntese dos genes globínicos - alfa-talassemia, algumas variantes de hemoglobina, delta-beta talassemia ou beta-talassemia em associação com delta-talassemia. O diagnóstico diferencial só pode ser feito através de técnicas de biologia molecular. Em Portugal as mutações a.T-tal mais frequentes são as delecções de 3,7 e 4,2 Kb, estando descritos alguns casos esporádicos de a°- tal ("MED e -((x)20'5) e mutações não deleccionais. Este estudo teve como objectivo determinar as alterações moleculares responsáveis pela hipocromia e microcitose hereditárias num grupo de indivíduos com Hb Ag normal, e em que não foram detectadas variantes de Hb por métodos cromatográficos/electroforécticos. Foram estudadas 57 amostras de indivíduos (adultos e crianças) com Volume Globular Médio (VGM) e Hemoglobina Globular Média (HGM) abaixo dos valores normais para a idade, doseamentos normais de Hb Ag (<3, 5 %) e Hb F (<2%) e com níveis normais de ferro. De acordo com os parâmetros hematológicos, as amostras foram divididas em dois grupos: os que apresentavam valores de VGM e HGM nos limites inferiores dos estabelecidos para a população padrão (Grupo l) e os que apresentavam VGM e HGM mais baixos (Grupo II). Nos dois grupos foram pesquisadas as delecções alfatalassémicas mais comuns (-a37, -a42; "MED e -(a)205), utilizando Gap-PCR. Nalgumas amostras pesquisaram-se mutações no gene beta-globínico através de SSCP e sequenciação. As amostras do Grupo II negativas para as delecções alfa-tal mais comuns foram estudadas por outras técnicas: Southern-blote hibridação para testar a presença de grandes delecções nos genes alfa-globínicos e a sequenciação dos mesmos genes para detectar mutações não deleccionais. No Grupo l, com 34 amostras, 11 eram heterozigóticas -a3'7 e 1 heterozigótica -a4'2; nas restantes 22 não se encontraram mutações nos genes alfa e beta globínicos. No Grupo II, com 23 amostras, 3 eram homozigóticas -a3'7, 1 heterozigótica composta -aJ-a4'2 e uma heterozigótica -a . Um indivíduo era heterozigótico para a variante Hb Plasencia (0.2(125)CTG-*CGG); um heterozigótico para a delecção a2-IVSII-1(-G); um duplo heterozigótico para a delecção ai (CDs 82-84) /inserção (5 nts) e para uma grande delecção nos genes a-globínicos. Foi ainda detectado um indivíduo com dupla heterozigotia para as mutações P-IVS-1-1 (G-+A) e a delecção Corfu detta-7,2 kb no gene 6- globínico, in trans. Em 14 amostras não foi identificada qualquer alteração nos genes alfa ou beta. Como esperado, neste estudo de 57 amostras com hipocromia e microcitose com níveis normais de Hb Ag, a mutação mais comum foi a delecção de 3,7 Kb, nos genes alfa globínicos, no estado heterozigótico e homozigótico. No Grupo II, com valores mais baixos de VGM e HGM, foram encontradas mutações não deleccionais duas das quais não descritas anteriormente: delecção a.2-IVS-ll-1(-G), e delecção (CDs 82-84)/inserção (5 nts) no gene re,. O estudo molecular de amostras com parâmetros hematológicos semelhantes aos dos indivíduos incluídos no Grupo l deverá apenas ser realizado para aconselhamento genético. Nas amostras do Grupo II em qus não foi detectada qualquer mutação, sugere-se a pesquisa de mutações nos elementos de regulação da expressão dos genes alfa e beta, ou ainda nos factores transacting eritróides.

The presence of hypocromia and microcytosis with normal Hb Ag levels in an individual, after exclusion of iron deficiency, can be due to alpha-thalassemia, some Hb variants, deltabeta-thal or beta-thal in association with delta-thal. Differential diagnosis has to be done by molecular biology techniques. In Portugal the most frequent cx+-thai mutations are the 3,7 and 4,2 Kb deletions with sporadic cases of a°- thai (--MED and -(a)20'5) and non-deletional mutations. The aim of this study was to characterise at molecular level a group of samples with hypocromia, microcytosis and normal Hb Az levels and no detection of Hb variants by chromatographic/electrophoretic methods. 57 subjects (adults and children) with Mean Corpuscular Volume (MCV) and Mean Corpuscular Hemoglobin (MCH) below the normal values attending to the age, normal Kb Ag (<3,5 %), Hb F (<2%) and normal iron status were studied. According to the hematological parameters, samples were divided into two groups: those with borderline MCV and MCH values (Group I) and those with lower MCV and MCH (Group II). The two groups were screened for the most common alpha-deletions (-a , -a4 ; and -(a)20-5) using Gap-PCR. Beta-globin genes were screened for mutations by SSCP and sequenciation. Samples from Group II thai tested negative for the common alpha-thal mutations were studied by other techniques: Southern-blot hybridisation was used to test large alpha-globin gene deletions and alpha-globin gene sequencing was used to detect non-deletional mutations. In Group I, with 34 samples, 11 were heterozygous -a3'7 and 1 was heterozygous -a4'2; in the remaining 22 samples we could not find any alpha- or beta-globin gene mutations. In Group II, with 23 samples, 3 were homozygous - a , 1 compound heterozygous -a3'7/-a4'2 and one heterozygous -o;3'7. One individual was heterozygous for Hb Plasencia (a (125)CTG->CGG); one was heterozygous for a [a -IVS-IM(-G)] deletion; one was a compound heterozygous for an a, deletion (CDs 82-84) /insertion (5 nts) and a large alpha-globin gene deletion. Beta-gene analysis of remaining samples detected: one P-IVS-1-1 (G^A) associated in trans with delta-7. 2 kb Corfu deletion. In 14 samples we couldn't identify any alpha- or beta- alteration. As expected, in this study of 57 samples with hypocromia and microcytosis with normal Hb Ag levels the most common mutation found was the -a.3 Kb deletion, in heterozygous and homozygous state. In group II, with lower MCV and MCH values, two mutations not previously described were found: o-a-IVS- 11-1 (-G) deletion and a, deletion (CDs 82-84) /insertion (5 nts). The molecular study of samples as Group I individuals should only be done in genetic counselling cases. When no mutations were detected in Group II we suggest looking for mutations in the alpha and beta genes expression regulatory elements or in erytroid trans-acting factors mutations.