Estudo da imobilização da lacase em nanopartículas magnéticas e sua aplicação

Abstract

A lacase é uma enzima pertencente à família das multicopper blue oxidases, sendo responsável por catalisar a oxidação ou a redução de vários compostos. O potencial catalítico da lacase é amplamente conhecido, o que promove a investigação com vista à sua aplicação industrial. No entanto, para que a aplicação de uma enzima a larga escala seja viável, é necessário o estudo e a otimização de sistemas de imobilização. Embora existam atualmente diversos materiais que são usados como suportes de imobilização, o recente desenvolvimento da nanotecnologia possibilitou o aparecimento de novos materiais, nomeadamente as nanopartículas magnéticas (MNPs). A sua elevada área superficial, que permite uma elevada taxa de transferência de massa, combinada com a sua fácil remoção dos meios reacionais, torna as MNPs promissores suportes de imobilização. Desta forma, foi estudada a imobilização da lacase em MNPs com vista à remoção de corantes. A primeira parte do trabalho envolveu a preparação das MNPs e a sua posterior caraterização, recorrendo a diversas técnicas analíticas. O sucesso da síntese das MNPs foi avaliado através de análise elementar e de FTIR. As imagens de TEM mostraram a forma esférica das MNPs com cerca de 50 nm de diâmetro e o seu revestimento com sílica. A área superficial específica foi analisada através de adsorção de azoto BET. Por fim, a análise de potencial zeta determinou a carga superficial negativa das MNPs e demonstrou a sua elevada estabilidade coloidal. A segunda parte do trabalho envolveu a otimização das condições de imobilização da lacase nas MNPs, nomeadamente a concentração de iões cobre e o pH, e a consequente avaliação da estabilidade do sistema catalítico. Nas condições ótimas, isto é, 1 mole de iões cobre por cada mole de EDTATMS funcionalizado na superfície das MNPs e pH 3,5, a lacase imobilizada apresentou uma atividade recuperada de 97,4±0,6%. Na avaliação da estabilidade da lacase livre e imobilizada, foram estudadas as estabilidades térmica, operacional e de armazenamento. No caso da estabilidade térmica a 40°C, verificou-se um aumento da atividade recuperada com a imobilização. Em relação à estabilidade operacional, demonstrou-se que, após 10 ciclos reativos consecutivos, a lacase imobilizada apresentava ainda 46,3±2,4% de atividade. Quanto ao armazenamento, a lacase em ambas as formas apresentou reduzida estabilidade. A última parte do trabalho envolveu a aplicação do sistema mediador de lacase (LMS) na remoção de corantes, nomeadamente o Vermelho do Congo (VC) e o Índigo de Carmim (IC), utilizando o metilseringato (MS) como mediador. Relativamente à degradação do IC, foi obtida uma remoção de 43,8±1,1% utilizando 0,500 mM de MS. Por sua vez, a degradação do VC não foi possível de quantificar, uma vez que a ocorrência de reações secundárias entre o produto de oxidação do VC e o mediador mascararam a absorvância medida. Em suma, os resultados obtidos permitem concluir que a aplicação industrial da lacase imobilizada nas MNPs preparadas apresenta um potencial inegável. Contudo, é ainda necessário que sejam ultrapassadas algumas das limitações detetadas no sistema de imobilização.

Laccases are enzymes that belong to the multicopper blue oxidases family, responsible for catalyzing redox reactions of several compounds. The catalytic potential of laccases is widely known, which promotes the research in order to its industrial application. However, the study and optimization of enzymatic immobilization systems are required to make possible the large-scale application. Although there are many materials that are used as immobilization supports, the nanotechnology development provides the discovery of new materials, namely the magnetic nanoparticles (MNPs). The MNPs high surface area that allows a high rate of mass transfer combined with its easy removal from reactional bulks make them promising immobilization supports. Therefore, it was studied the laccase immobilization on the MNPs in order to dye removal. The first part of the work involved the MNPs preparation and their characterization, through several analytical methods. The success of the MNPs synthesis was evaluated by elemental analysis and FTIR. The TEM images showed a spherical form of the MNPs with about 50 nm of diameter and an amorphous silica coating. The specific surface area was measured by nitrogen adsorption BET. Finally, the zeta potential analysis showed the negative charge of the MNPs and proved its high colloidal stability. The second part of the work involved the optimization of the laccase immobilization conditions on the MNPs, namely the copper ions proportion and the pH as well as the evaluation of the catalytic system stability. Under the optimal conditions, i.e. 1 mole of copper ions for each mole of EDTA-TMS that was functionalized at the MNPs surface and a pH 3.5, the activity recovery of the immobilized laccase was 97.4±0.6%. To evaluate the stability of free and immobilized laccase, the thermal, operational and storage stability were studied. In the case of the thermal stability at 40°C, there was an increase in the recovered activity with the immobilization process. Regarding to the operational stability, it was shown that after 10 sequential reactive cycles, the enzyme presentes 46.3±2.4% of activity. Lastly, the free and immobilized laccase still presented low storage stability. The last part of the work involved the application of the laccase mediator system (LMS) in the dye removal, namely the Congo Red (VC) and the Indigo Carmine (IC), using methyl syringate (MS) as mediator. Relatively to the IC degradation, a removal of 43.8±1.1% was obtained, using 0.500 mM of MS. The VC degradation was not possible to quantify since the occurrence of secondary reactions between the VC oxidation product and the mediator masked the measured absorbance The results of this work showed that the industrial application of immobilized laccase on the prepared MNPs has an undeniable potential. However, it is still necessary to overcome some of the system limitations.