Volatile exometabolone analysis of Aspergillus niger and search for molecular biomarkers pattern

Abstract

Fungal infections have greatly increased in risk populations, namely in immunocompromised patients, probabily because the diagnosis of fungal infections is delayed. Microbial metabolomics arises as a powerful feature screening the metabolites produced by microorganisms. It provides information regarding the state of biological organisms which can be used as a diagnostic tool for diseases through fungal metabolites pattern. Thus, this research aimed to in-depth study of the Aspergillus niger exometabolome, in order to establish a targeted metabolomic pattern that characterizes A. niger. A methodology based on headspace-solid phase microextraction combined with comprehensive two-dimensional gas chromatography coupled to mass spectrometry with a high resolution time of flight analyser (HS-SPME/GC×GC-ToFMS) was used. A. niger exometabolome was analysed in different growth conditions: temperature (25 and 37 °C), incubation time (3 and 5 days), and culture medium (solid and liquid medium). A. niger exometabolome included 430 metabolites, distributed over several chemical families, being the major ones alcohols, aldehydes, esters, hydrocarbons, ketones and terpenoids. Differences among volatile metabolites produced under different growth conditions were observed, being the major relative abundance determined for 5 days of growth, at 25 °C, using solid medium. These results indicated the high complexity of A. niger exometabolome. A subset of 44 metabolites, which were present in all previously tested growth conditions, was defined as the A. niger targeted metabolomic pattern. This pattern may be used in detection of fungal infections by this specie and be further exploited to fungal infections diagnosis. Furthermore, this subset of metabolites was compared with samples of Candida albicans (yeast) and Penicillium chrysogenum (filamentous fungi), and Partial Least Squares Discriminant Analysis (PLS-DA) was applied. The results clearly showed that this metabolites subset allowed the distinction between these microorganisms. In order to validate the PLS-DA model, permutation test was applied, and a statistically significant model for 44 metabolites was obtained with a predictive Q2 capability of 0.70 for A. niger. When the subset of compounds were reduced to 16 (obtained by Variables Importance in Projection (VIP) parameter), the obtained model had a predictive Q2 capability of 0.86 for A. niger, which was significantly higher, being more robust than the previous. The decrease of 44 to 16 metabolites, reduced the require analysis time and the conditions used were similar to the conditions used in clinical context, (solid medium, at 25 °C and ca. 1 week). However, in this study was possible to reduce the time for 3 days. In conclusion, these 44 volatile molecular biomarkers could be useful for diagnosis of fungal infections, and they can even be further exploited in clinical context.

As infeções fúngicas têm aumentado bastante em populações de risco, nomeadamente em pacientes imunocomprometidos, provavelmente devido a atrasos no diagnóstico das infeções fúngicas. A metabolómica microbiana surge como um poderoso recurso de triagem dos metabolitos produzidos por microrganismos. Esta fornece informações sobre o estado de organismos biológicos, que podem ser usados como uma ferramenta de diagnóstico para infeções fúngicas através de um padrão de metabolitos fúngicos. Assim, este trabalho teve como objetivo estudar em profundidade o exometaboloma de Aspergillus niger, a fim de estabelecer um padrão metobolómico alvo que caracterize o A. niger. Foi usada uma metodologia baseada em microextração em fase sólida no espaço de cabeça combinada com cromatografia de gás bidimensional abrangente acoplada a espectrometria de massa por tempo de voo (HS-SPME / GC×GC-ToFMS). O exometaboloma de A. niger foi analisado em diferentes condições de crescimento: temperatura (25 e 37 °C), tempo de incubação (3 e 5 dias) e meio de cultura (meio sólido e líquido). O exometaboloma do A. niger incluiu 430 metabolitos, distribuídos em várias famílias químicas, sendo os mais importantes os álcoois, aldeídos, ésteres, cetonas, hidrocarbonetos e terpenos. Observaram-se diferenças entre os metabolitos voláteis produzidos em diferentes condições de crescimento, sendo a maior abundância relativa determinada para os 5 dias de crescimento, a 25 °C, utilizando meio sólido. Estes resultados indicaram a alta complexidade do exometaboloma do A. niger. Um subconjunto de 44 metabolitos, que estavam presentes em todas as condições de crescimento testadas, foi definido como um padrão metabolómico alvo para o A. niger. Este padrão pode ser usado na deteção de infeções fúngicas por esta espécie e ser futuramente explorado para diagnóstico de infeções fúngicas. Além disso, este subconjunto de metabolitos foi comparado com amostras de Candida albicans (levedura) e Penicillium chrysogenum (fungo filamentoso), e a análise discriminante com método dos mínimos quadrados parciais (PLS-DA) foi aplicada. Os resultados mostraram claramente que este subconjunto de metabolitos permitiu distinguir estes microrganismos. Para validar o modelo do PLS-DA, o teste das permutações foi aplicado, e um modelo estatísticamente significante para os 44 metabolitos foi obtido com uma capacidade preditiva Q2 de 0.70 para o A. niger. Quando o subconjunto de compostos foi reduzido para 16 (obtidos pelo parâmetro Importância da Variável na Projeção (VIP)), o modelo obtido teve uma capacidade preditiva Q2 de 0.86 para o A. niger, que foi significantemente superior, sendo mais robusto que o anterior. A diminuição de 44 para 16 metabolitos, reduziu o tempo de análise necessário e as condições utilizadas foram semelhantes às condições utilizadas em contexto clínico, (meio sólido e 25 °C e aproximadamente 1 semana). No entanto, neste estudo, foi possível reduzir o tempo para 3 dias. Em conclusão, estes 44 biomarcadores moleculares voláteis poderão ser úteis para o diagnóstico de infeções fúngicas, e podem ser explorados em contexto clínico.