Efeitos centrais e periféricos da toxina botulínica do tipo A : aplicações na urologia

Abstract

O serotipo A da toxina botulínica (BoNT/A), nomeadamente a formulação onabotulinumtoxinA (onabotA), tem vindo a ser amplamente utilizado na prática clínica. Este facto deve-se ao seu efeito proteolítico sobre a proteína associada ao sinaptossoma com 25 kDa (SNAP-25) e ao consequente bloqueio da exocitose e da neurotransmissão. É com base na sua ação que a toxina é indicada para o tratamento da incontinência urinária relacionada com a hiperatividade do músculo detrusor (DO) e com a dissinergia vesico-esfincteriana. Contudo, a sua aplicação tem vindo a ser alargada a outras patologias do trato urinário inferior caracterizadas por contrações musculares excessivas ou por dor. O mecanismo pelo qual a toxina exerce um efeito antinociceptivo carece de fundamentação científica, pelo que vários estudos têm vindo a ser desenvolvidos com o objetivo de clarificar a sua ação em nociceptores periféricos e centrais. Surgiram então como objetivos da presente tese avaliar a possibilidade da toxina sofrer transporte axonal para a região da medula espinhal que recebe aferentes primários provenientes da bexiga e estudar o seu efeito direto no sistema nervoso central. Adicionalmente, pretendeu-se determinar uma taxa de conversão de doses correspondente às formulações onabotulinumtoxinA e a abobotulinumtoxinA (abobotA) para utilização clinica na área da urologia. Após administração de onabotA na parede da bexiga e no espaço intratecal detetou-se a presença de SNAP-25 clivada (cSNAP-25) maioritariamente nas lâminas superficiais do corno dorsal do segmento medular L6, que recebe aferentes primários provenientes da bexiga. A expressão de cSNAP-25 foi bastante marcada na medula espinhal de animais tratados com a toxina e apenas num pequeno número de fibras foi detetada colocalização com marcadores de terminais colinérgicos. Não foi detetada colocalização com marcadores de fibras sensitivas peptidérgicas, e com marcadores estruturais de neurónios e de células da glia. Através da análise ultraestrutural detetou-se a presença de um elevado número de vesículas sinápticas adjacentes à membrana pré-sináptica e de uma quantidade excessiva de mitocôndrias nos terminais neuronais, nos animais que receberam onabotA. A análise global dos resultados permitiu concluir que a toxina atua maioritariamente na região dos aferentes primários do segmento L6 da medula espinhal e que o seu efeito é observado num grande número de fibras cujo conteúdo neuroquímico não foi possível definir por imunofluorescência. O estudo da ultraestrutura permitiu detetar alterações nos neurónios do segmento L6 de animais tratados com a toxina que podem estar associadas à ausência de colocalização da cSNAP-25 com os diversos marcadores testados. Adicionalmente, procedeu-se à injeção única da mesma dose unitária de onabotA ou abobotA na zona superior da cúpula e as fibras imunorreativas contra a cSNAP-25 detetadas na bexiga foram contabilizadas. A comparação entre o número médio de fibras correspondente a cada um dos grupos experimentais sugere que a onabotA é 1,7 vezes mais potente do que a abobotA. Assim, no caso específico da aplicação no detrusor deve ser considerada a razão de 1:1,7 para conversão das doses de onabotA e abobotA, respetivamente.

Botulinum toxin type A (BoNT/A), mainly the onabotulinumtoxinA (onabotA) formulation, has been extensively used in clinical practice. This fact is due to its proteolytic effect on the synaptossomal-associated protein of 25 kDa (SNAP-25) and to the consequent blockade of exocytosis and neurotransmission. Based on its mechanism of action, the toxin has been indicated for the treatment of urinary incontinence related to detrusor overactivity (DO) or to vesico sphincter dyssynergia. However, the toxin utility has been expanded to other lower urinary tract disorders characterized by excessive muscular contractions or pain. The mechanism by which the toxin exerts an antinociceptive effect needs scientific background. So, many studies have been developed in order to clarify its activity in peripheral and central nociceptors. Therefore, the main goals of this thesis were to evaluate the possibility of the toxin undergo through axonal transport for the spinal cord region that receives primary afferents from the urinary baldder and to study its direct effect in the central nervous system. Additionally, we intend to determine a dose conversion ratio of onabotulinumtoxinA and abobotulinumtoxinA (abobotA) for use in clinical urology. After onabotA administration in the bladder wall and in the intrathecal space it was detected the presence of cleaved SNAP-25 (cSNAP-25) mainly at the superficial lamina of the dorsal horn of the L6 spinal segment, which receives bladder primary afferents. The expression of cSNAP-25 was markedly observed in the spinal cord and only a small number of immunoreactive fibers presented colocalization with markers of cholinergic terminals. It was not observed colocalization with markers of peptidergic sensitive fibers and with neuron or glial specific markers. By the ultrastructural analysis it was detected the presence of a high number of synaptic vesicles adjacent to the pre-synaptic membrane and an excessive number of mitochondria inside the neurons of animals that received onabotA. The global analysis of the results allowed us to conclude that the toxin acts mainly at the primary afferents region of the L6 spinal segment and that its effect is detected in a high number of fibers which neurochemical content was not possible to determine by immunofluorescence. The ultrastructural study lead us to detect neuronal alterations at the L6 medullary segment of animals treated with the toxin that may be related to the absence of cSNAP-25 colocalization with different tested markers. Additionally, a unique injection of the same unitary dose of onabotA and abobotA was administered at the top of the bladder dome and immunoreactive cSNAP-25 fibers were counted in the bladder. The comparison of the average number of immunoreactive fibers of each experimental group suggests that onabotA is 1,7 times more potent than abobotA. Therefore, in the specific case of detrusor administration it should be considered a 1:1,7 ratio for onabotA and abobotA dose conversion.