Imobilização de lacase em nanopartículas de magnetite

Abstract

As excelentes propriedades catalíticas têm aumentado o uso de enzimas na biocatálise industrial. Contudo, como normalmente são solúveis, apresentam desvantagens como a dificuldade de recuperação da enzima da solução reacional e a sua reutilização. De modo a reutilizar uma enzima solúvel, a sua imobilização tem sido utilizada, nos mais diversos tipos de suportes e usando metodologias variadas. Neste sentido, estudou-se a imobilização da lacase em nanopartículas magnéticas de magnetite, revestidas com sílica (Fe3O4-SiO2) e ativadas com glutaraldeído. Na primeira fase deste trabalho, com o objetivo de maximizar a recuperação de atividade enzimática, estudou-se a otimização das condições da imobilização, através do uso da metodologia de superfície de resposta, tendo como variáveis independentes o pH (4.5, 6.5 e 8.5), a concentração da enzima (0.03, 0.1 e 0.17 μL/mL) e o tempo de contato (1.0, 2.0 e 3.0h). As condições ótimas de imobilização encontradas foram a concentração de enzima 0.03 μL/mL, pH 5 e tempo de contato de 3h. Numa segunda fase, investigou-se a estabilidade térmica da lacase livre e imobilizada, estabilidade operacional ou capacidade de reutilização e o efeito do armazenamento na enzima imobilizada. Verificou-se que a estabilidade térmica da lacase imobilizada, em relação à lacase livre, foi ligeiramente melhorada. A retenção de 75,8 % da atividade inicial após 6 ciclos de reação mostraram claramente que a estabilidade operacional e a capacidade de reutilização do biocatalisador foi melhorada em relação à enzima livre. Na terceira fase determinou-se a cinética da reação de oxidação do ABTS, catalisada pela lacase imobilizada e comparou-se com a cinética da enzima livre. Os resultados foram modelados usando o modelo de Michaelis-Menten, e constatou-se que um aumento substancial do valor da constante de Michaelis-Menten, em relação à enzima livre, certamente provém de uma menor afinidade da enzima imobilizada para o substrato e ou por limitações de transferência de massa. Conclui-se que as propriedades melhoradas da lacase imobilizada em nanopartículas, assim como as vantagens de reutilização, aproveitando as propriedades magnéticas das nanopartículas, mostram que a lacase imobilizada nestes suportes apresenta potencial para aplicações industriais.

Due to their excellent catalytic properties, there is an increase of the use of enzymes in industrial biocatalysis. However because normally they are in the soluble state, there are disadvantages such as the difficulty of recovering the enzyme from the solution where occurs the reaction and its posterior reutilization. In order to reuse the soluble enzymein an industrial reactor, the enzyme can be immobilized in various supports using different immobilization methodologies. The main objective of this work was to study the immobilization of laccase on magnetic nanoparticles of magnetite coated with silica (Fe3O4-SiO2) and activated with glutaraldehyde. In the first stage of this work the optimization of the conditions for the immobilization of laccase was studied, through the use of a response surface methodology, taking as independent variables pH (4.5, 6.5 and 8.5), the concentration of the enzyme (0.03, 0.10 and 0.17 μL/mL) and contact time (1.0, 2.0 and 3.0h) with the purpose of maximizing the recovery of enzyme activity. The optimal experimental conditions for the immobilization were enzyme concentration 0.03 μL/mL, pH 5 and contact time of 3h. In a second stage, investigation of the thermal stability of laccase, operational stability and reusability and the effect of storage on the immobilized enzyme was carried out. It was found that the thermal stability of the immobilized laccase comparing to the free laccase was slightly improved. The retention of 75.8% of initial activity after 6 cycles of operation clearly showed the good operational stability and reusability. Later the kinetics of oxidation of ABTS, catalyzed by immobilized laccase was determined and compared with the kinetics of the free enzyme. The results of the oxidation of ABTS by laccase immobilized were modeled using the Michaelis-Menten model, and it was found that a substantial increase in the value of the Michaelis-Menten constant by comparing to the free enzyme, certainly comes from a lower affinity of the immobilized enzyme for the substrate or by limitation in mass tranfer. As conclusion, there was an improvement in the proprieties of immobilized laccase on magnetic nanoparticles as well as the benefits of reuse, taking advantage of the magnetic properties of the nanoparticles and showing that laccase immobilized in these carriers has enormous potential for industrial application.