Characterisation of ZG16p, a unique mammalian lectin from pancreatic zymogen granules

Abstract

The mechanisms of secretory granule biogenesis and regulated secretion of digestive enzymes in pancreatic acinar cells are still not well understood. To shed light on these processes, which are of biological and clinical importance (e.g., pancreatitis), a better molecular understanding of the components of the granule membrane, their functions and interactions is required. The application of proteomics has largely contributed to the identification of novel zymogen granule (ZG) proteins but was not yet accompanied by a better characterization of their functions. In this study we aimed at a) isolation and identification of novel membrane-associated ZG proteins; b) characterization of the biochemical properties and function of the secretory lectin ZG16p, a membrane-associated protein; c) exploring the potential of ZG16p as a new tool to label the endolysosomal compartment. First, we have performed a suborganellar proteomics approach by combining protein analysis by 2D-PAGE and identification by mass spectrometry, which has led to the identification of novel peripheral ZGM proteins with proteoglycan-binding properties (e.g., chymase, PpiB). Then, we have unveiled new molecular properties and (multiple) functions of the secretory lectin ZG16p. ZG16p is a unique mammalian lectin with glycan and proteoglycan binding properties. Here, I revealed for the first time that ZG16p is highly protease resistant by developing an enterokinase-digestion assay. In addition I revealed that ZG16p binds to a high molecular weight complex at the ZGM (which is also protease resistant) and forms highly stable dimers. In light of these findings I suggest that ZG16p is a key component of a predicted submembranous granule matrix attached to the luminal side of the ZGM that fulfils important functions during sorting and packaging of zymogens. ZG16p, may act as a linker between the matrix and aggregated zymogens due to dimer formation. Furthermore, ZG16p protease resistance might be of higher importance after secretion since it is known that ZG16p binds to pathogenic fungi in the gut. I have further investigated the role of ZG16p binding motifs in its targeting to ZG in AR42J cells, a pancreatic model system. Point mutations of the glycan and the proteoglycan binding motifs did not inhibit the targeting of ZG16p to ZG in AR42J cells. I have also demonstrated that when ZG16p is present in the cytoplasm it interacts with and modulates the endo-lysosomal compartment. Since it is known that impaired autophagy due to lysosomal malfunction is involved in the course of pancreatitis, a potential role of ZG16p in pancreatitis is discussed.

Os mecanismos de biogénese dos grânulos secretores e a secreção regulada das enzimas digestivas, nas células acinares do pâncreas, ainda não são totalmente compreendidos. Para esclarecer estes processos, que são de importância biológica e clínica (ex., pancreatite), é necessário um melhor conhecimento molecular dos componentes da membrana dos grânulos, as suas funções e interações. A aplicação da proteómica contribuiu largamente para a identificação de novas proteínas dos grânulos de zimogénio (ZG) mas ainda não foi acompanhada por uma melhor caracterização das suas funções. Este estudo teve como objectivos a) o isolamento e identificação de novas proteínas associadas à membrana dos ZG; b) a caracterização das propriedades bioquímicas e da função da lectina ZG16p, uma proteína associada a membrana dos ZG; c) explorar o potencial da ZG16p como uma nova ferramenta para marcar o compartimento endolisossomal. Inicialmente, efetuamos uma abordagem proteómica ao estudo das frações dos ZG, a qual nos levou à identificação de novas proteínas periféricas da ZGM com capacidade de se ligarem a proteoglicanos (Chymase e PpiB). Depois, começamos a desvendar as propriedades moleculares e (múltiplas) funções da lectina ZG16p. A ZG16p é uma proteína única nos mamíferos com capacidade de se ligar a glicanos e a proteoglicanos. Pela primeira vez, foi revelado que a ZG16p é extremamente resistente a proteases através do desenvolvimento de um ensaio de digestão com enterokinase. Adicionalmente, demonstrei que a ZG16p se liga a um complexo de elevado peso molecular (também resistente a proteases) e forma homodímeros muito estáveis. À luz destas descobertas, nós sugerimos que a ZG16p poderá actuar como um elo de ligação aos proteoglicanos, ajudando na formação e estabilização de uma rede/estrutura (matriz submembranar) ligada ao lúmen da ZGM, que desempenhará uma função importante durante a segregação e empacotamento dos zimogénios. A ZG16p poderá atuar como um elo de ligação entre a matriz e os zimogénios agregados devido à sua capacidade para formar dímeros. Adicionalmente, a resistência da ZG16p a protéases poderá ser de maior importância após a secreção, uma vez que é sabido que a ZG16p se liga a fungos patogénicos nos intestinos. Investiguei ainda, o papel dos domínios de ligação da ZG16p na sua segregação para os ZG em células AR42J, um modelo pancreático. A mutação pontual dos motivos de ligação a glicanos e a proteoglicanos não alterou a segregação da ZG16p para os ZG. Também demonstrei que quando a ZG16p se encontra no citoplasma liga-se ao compartimento endolisossomal. Como é sabido, a desregulação da autofagia devido ao funcionamento defeituoso dos lisossomas está associado à pancreatite, por isso iremos discutir o papel potencial da ZG16p nesta doença.