The effects of chemicals in isopods: a multi-organizational evaluation

Abstract

The global aim of this thesis was to evaluate and assess the effects of a pesticide (dimethoate) and a metal (nickel), as model chemicals, within different organization levels, starting at the detoxification pathways (enzymatic biomarkers) and energy costs associated (energy content quantification, energy consumption and CEA) along with the physiological alterations at the individual and population level (mortality), leading to a metabolomic analysis (using liquid 1H-NMR) and finally a gene expression analysis (transcriptome and RT-qPCR analysis). To better understand potential variations in response to stressors, abiotic factors were also assessed in terrestrial isopods such as temperature, soil moisture and UV radiation. The evaluation performed using biochemical biomarkers and energy related parameters showed that increases in temperature might negatively affect the organisms by generating oxidative stress. It also showed that this species is acclimated to environments with low soil moisture, and that in high moisture scenarios there was a short gap between the optimal and adverse conditions that led to increased mortality. As for UV-R, doses nowadays present have shown to induce significant negative impact on these organisms. The long-term exposure to dimethoate showed that besides the neurotoxicity resulting from acetylcholinesterase inhibition, this stressor also caused oxidative stress. This effect was observed for both concentrations used (recommended field dose application and a below EC50 value) and that its combination with different temperatures (20ºC and 25ºC) showed different response patterns. It was also observed that dimethoate’s degradation rate in soils was higher in the presence of isopods. In a similar study performed with nickel, oxidative stress was also observed. But, in the case of this stressor exposure, organisms showed a strategy where the energetic costs necessary for detoxification (biomarkers) seemed to be compensated by positive alterations in the energy related parameters. In this work we presented for the first time a metabolomic profile of terrestrial isopods exposed to stressors (dimethoate and niquel), since until the moment only a previous study was performed on a metabolomic evaluation in nonexposed isopods. In the first part of the study we identify 24 new metabolites that had not been described previously. On the second part of the study a metabolomic profile variation of abstract non-exposed organism throughout the exposure was presented and finally the metabolomic profile of organisms exposed to dimethoate and nickel. The exposure to nickel suggested alteration in growth, moult, haemocyanin and glutathione synthesis, energy pathways and in osmoregulation. As for the exposure to dimethoate alterations in osmoregulation, energy pathways, moult and neurotransmission were also suggested. In this work it was also presented the first full body transcriptome of a terrestrial isopod from the species Porcellionides pruinosus, which will complement the scarce information available for this group of organisms. This transcriptome also served as base for a RNA-Seq and a RT-qPCR analysis. The results of the RNA-Seq analysis performed in organisms exposed to nickel showed that this stressor negatively impacted at the genetic and epigenetic levels, in the trafficking, storage and elimination of metals, generates oxidative stress, inducing neurotoxicity and also affecting reproduction. These results were confirmed through RT-qPCR. As for the impact of dimethoate on these organisms it was only accessed through RT-qPCR and showed oxidative stress, an impact in neurotransmission, in epigenetic markers, DNA repair and cell cycle impairment. This study allowed the design of an Adverse Outcome Pathway draft that can be used further on for legislative purposes.

Os efeitos negativos de contaminantes de origem antropogénica que aparecem no meio ambiente têm um impacto negativo muitas vezes em organismos considerados benéficos. Dentro deste grupo de organismos podemos incluir os isópodes terrestres, detritivorous, cuja função se baseia na fragmentação de matéria vegetal, que poderão posteriormente ser facilmente colonizados por bactérias e os seus nutrientes incorporados nos solos. Para avaliar os efeitos de contaminantes em isópodes terrestres, mais concretamente na espécie Porcellionides pruinosus, foram usados como modelos o metal níquel e o pesticida dimetoato, fazendo uma abordagem em diferentes níveis organizacionais. O trabalho iniciou-se pela avaliação do impacto a nível das vias de destoxificação (biomarcadores enzimáticos) e reservas energéticas (quantificação das reservas, consumo energético e alocação da energia celular), juntamente com alterações a nível dos indivíduos e da população (mortalidade), passando por uma análise de metabolómica (usando 1H-RMN de líquidos) e finalmente uma análise da expressão génica (transcriptoma e RT-qPCR). De forma a melhor entender as variações que podem ocorrer oriundas de variações de fatores abióticos, foi também realizado um estudo sob os efeitos da variação de temperatura, humidade do solo e radiação UV em isópodes terrestres. A avaliação feita a nível dos biomarcadores bioquímicos, quantificação das reservas e parâmetros energéticos demonstrou que o aumento da temperatura iria afectar negativamente os organismos devido ao stress oxidativo gerado. Tendo em conta que esta espécie está aclimatada a ambientes com solos com humidades baixas, a exposição a solos com humidades superiores mostrou a existência de um pequeno intervalo entre o que são consideradas condições óptimas e condições bastante adversas, sendo aí verifica uma elevada mortalidade. Os efeitos da radiação UV demonstraram que as doses que actualmente chegam à superfície do planeta constituem uma ameaça para os isópodes terrestres. A avaliação feita à toxicidade do dimetoato em biomarcadores bioquímicos, reservas e parâmetros energéticos, demonstrou que além da toxicidade já esperada (inibição da enzima acetilcolinesterase), este stressor induz igualmente stress oxidativo. Este efeito foi observado para ambas as concentrações usadas (dose recomendada de aplicação em campo e dose próxima do EC50) e que a sua combinação com diferentes temperaturas (20ºC resumo e 25ºC) dava origem a diferentes padrões de resposta. Também foi observado que a taxa de degradação do dimetoato era superior em solos com a presença de isópodes. Num estudo semelhante ao anterior, realizado com níquel, foi observada toxicidade induzida por stress oxidativo. No entanto os organismos expostos a este stressor apresentam uma estratégia em que os custos energéticos associados à destoxificação (biomarcadores bioquímicos) parecem ser compensados com alterações positivas a nível dos parâmetros energéticos. Neste trabalho é apresentado pela primeira vez o perfil metabolómico de isópodes terrestres expostos a dimetoato e níquel, sendo que até à data apenas um estudo tinha apresentado o perfil metabólico de isópodes em situação de homeostasia. Na primeira parte do estudo é apresentado o perfil metabólico que identifica 24 novos metabolitos que ainda não tinham sido descritos anteriormente. Numa segunda parte é apresentada uma variação do perfil de organismos não expostos ao longo do ensaio e finalmente são apresentadas as variações metabólicas em organismos expostos a dimetoato e a níquel. Os resultados mostraram que ambos os stressores causaram alterações que eram dependentes da concentração e do tempo. Quando expostos a níquel os organismos evidenciam alterações ao nível do crescimento, muda e síntese de hemocianina e glutationas, alterações ao nível das vias energéticas e na osmorregulação. Em relação aos efeitos da exposição a dimetoato, foram observadas alterações a nível da osmorregulação, das vias energéticas e na muda, mas também ao nível da neurotransmissão. Neste trabalho é apresentado pela primeira vez um transcriptoma completo de um isópode terrestre, da espécie Porcellionides pruinosus. Este transcriptoma veio complementar a atual, mas parca, informação disponível sobre este grupo de organismos. Tendo como base o transcriptoma, foi posteriormente realizada uma análise de RNA-Seq e de RT-qPCR. A análise de RNA-Seq foi realizada apenas em organismos expostos a níquel e mostrou que este stressor tem um impacto ao nível genético e epigenético, no transporte, acumulação e eliminação de metais, gera stress oxidativo, neurotoxicidade e afecta também a reprodução. Estes resultados foram confirmados pela análise feita através de RT-qPCR. Em relação aos efeitos de dimetoato nestes organismos a nível genómico, a sua avaliação foi apenas realizada através de RT-qPCR. Foi observado que este stressor gera stress oxidativo, neurotoxicidade, tem um impacto em marcadores epigenéticos, na reparação de ADN e provoca alterações a nível da divisão celular. Este estudo permitiu a realização de uma “Adverse Outcome Pathway” (AOP) que poderá ser usada mais tarde para fins legislativos.