CD5, a molecular switch regulating signaling at the surface of T cells

Abstract

T cell receptor recognition of peptide-MHC expressed on antigen presenting cells (APC) involves the formation of a tight cell-cell contact area, named immunological synapse. Upon successful T cell activation, several signal transduction pathways are triggered culminating with the induction of gene transcription. The T cell surface glycoprotein CD5, an inhibitor of TCR signaling, is one of the molecules that targets to the immunological synapse upon T cell activation, although no ligand in the APCs has yet been discovered. We have determined that a sequence containing two tyrosine residues (Y429 and Y441) within the cytoplasmic domain of CD5 is determinant both in the inhibitory function as well as in the synaptic localization of the molecule. In the current project we dissect the role of each of the two tyrosine residues in the modulatory properties of CD5. For this purpose, tyrosine-to-phenylalanine substitutions were introduced in the CD5 molecule, which was expressed in a CD5- negative T cell line. These mutants will be relevant for unveiling the molecular mechanisms induced upon T cell receptor-mediating triggering, such as intracellular phosphorylation, calcium signals and proliferation. Our results in calcium and proliferation assays confirm the inhibitory role of the ITAM sequence, and more precisely, of the Y429 residue, although the other tyrosine may also play a somewhat lesser part. These mutants will also be analyzed by fluorescence microscopy for their ability to translocate to the immunological synapse upon T cell interaction with superantigen-loaded APCs. An additional CD5 mutant, one devoid of the extracellular domain, will also be monitored and will determine the requirement for an APCexpressed ligand to induce CD5 translocation to the synapse. We found two new putative intracellular binding partners that can be part of, and help assembling, CD5 signalosomes. In vitro studies show that CD5 can associate with the adapter protein Crk, maybe acting as a bridge to other protein-protein interactions. On the other hand, the calcium-binding protein S100A4 also associates with CD5, Fyn and Lck. We hypothesized that S100A4 controls Lck-dependent Tcell proliferation and Fyn-dependent differentiation of T helper subsets through a CD5-dependent mechanism, highlighting once again a putative role of CD5 as a molecular switch. In the future, CD5 can be used as a therapeutic target in order to modulate immune responses.

O reconhecimento por parte do receptor de células T (TCR) de péptidos processados e apresentados pelas células apresentadoras de antigénios (APC) via MHC envolve a formação de uma zona de contacto célula-célula, chamada sinapse imunológica. Após ativação das células T, diversas vias de sinalização celular são ativadas culminando na indução de transcrição génica. A glicoproteína de superfície, CD5, é considerada um inibidor da ativação via TCR, sendo uma das primeiras moléculas a ser recrutada para a sinapse imunológica após ativação da célula T. No entanto, até ao momento nenhum ligando na célula apresentadora de antigénios foi devidamente identificado e aceite como sendo o ligando do CD5. No nosso grupo, foi estabelecido que a sequência da cauda citoplasmática do CD5 que contém dois resíduos de tirosina (Y429 e Y441) é determinante para a sua função inibitória bem como para a translocação desta molécula para a sinapse imunológica. Neste projeto, propomos dissecar o papel de cada uma destas duas tirosinas nas propriedades modulatórias do CD5. Com esse propósito, foram introduzidas substituições na molécula do CD5, substituindo cada uma das referidas tirosinas por fenilalaninas. Estes mutantes foram expressos numa linha celular negativa para a expressão de CD5 endógeno e ajudarão a desvendar os mecanismos moleculares induzidos após ativação das células T e através dos quais o CD5 exerce o seu papel inibitório, avaliando por exemplo, fosforilação intracelular, fluxos de cálcio, e proliferação. Os nossos resultados nos ensaios de cálcio e de proliferação vieram confirmar o papel inibitório do pseudo-ITAM e, mais precisamente, da tirosina Y429. Estes mutantes serão também analisados por microscopia de fluorescência para avaliar a sua responsabilidade na mobilização do CD5 para a sinapse imunológica. Adicionalmente, será também monitorizada esta mobilização num mutante desprovido da porção extracelular, de forma a determinar a necessidade de estimulação por parte de um ligando expresso na célula apresentadora de antigénios. Um dos nossos resultados pioneiros mostram uma associação entre o CD5 e a proteína adaptadora Crk, que poderá funcionar como uma ponte para outras interações. A proteína dependente de cálcio S100A4 também se associa com CD5 bem como a Fyn e Lck, levando-nos a propor que S100A4 controla os mecanismos de proliferação e de diferenciação de populações de células T auxiliares, dependentes de Lck e de Fyn, respetivamente, através de um mecanismo dependente do CD5. No futuro, CD5 poderá ser usado como alvo terapêutico com o objetivo de modular a resposta imune.