Characterization of novel LAP1 complexes and their relevance in DYT1 dystonia

Abstract

Dystonia is the third most common movement disorder, following essential tremor and Parkinson’s disease, and comprises a large number of clinical syndromes. DYT1 dystonia is recognized as the most common form of early onset isolated dystonia and is caused by a mutation in the DYT1 gene, resulting in the loss of a single glutamic acid within the torsinA protein (ΔE-torsinA). TorsinA resides in the endoplasmic reticulum and nuclear envelope (NE), but the mutant form is abnormally relocated to the NE. At the NE, torsinA interacts with lamina associated polypeptide 1 (LAP1), whose function is poorly understood. LAP1 is a transmembrane protein of the inner nuclear membrane that was described to exist as three alternatively spliced isoforms (LAP1A, B and C) in rat. Protein-protein interactions are becoming increasingly important in the study of human diseases and signaling pathways. In this work, human LAP1B was identified as a novel protein phosphatase 1 (PP1) binding protein. PP1 is a major Ser/Thr phosphatase that is estimated to dephosphorylate about one third of all proteins in eukaryotic cells. The versatility of PP1 is only possible by complexing with different binding proteins that play regulatory and targeting roles. We found that LAP1B is a substrate of PP1 and binds to the latter through an RVxF-like motif located in the nucleoplasmic domain. In the course of this work, we also identified a novel human LAP1 isoform - LAP1C that is N-terminally truncated. Human LAP1B and LAP1C isoforms seem to be developmentally regulated and are both dephosphorylated by PP1. Moreover, LAP1 proteins seem to be important for NE integrity and mitosis regulation. Given that PP1 interacts with LAP1 in the nucleoplasm, which in turn interacts with torsinA in the perinuclear space, the existence of the tricomplex PP1/LAP1/torsinA was validated in rat brain and cultured cells. Moreover, torsinA was dephosphorylated by PP1 but probably binds to the latter via LAP1. The aberrant behavior of ΔE-torsinA in the NE implicates nuclear dysfunction in DYT1 dystonia pathogenesis. Thereby, the role of LAP1 complexes in the NE and its regulation by protein phosphorylation may underlie the pathology of DYT1 dystonia and other NE-related diseases. Moreover, DYT1 dystonia has been related with a dysfunction in the basal ganglia circuit, including dopamine signaling disturbance. Interestingly, PP1/DARPP-32 cascade plays a key role in mediating the actions of dopamine and modulating the phosphorylation and activity of effectors in dopaminoceptors neurons. Thus, our results may lead to novel insights into the molecular and cellular mechanisms of DYT1 dystonia, where protein phosphorylation cascades represent a regulatory mechanism.

A distonia é a terceira doença de movimento mais comum depois do tremor essencial e da doença de Parkinson e abrange um variado número de síndromes clínicos. A distonia DYT1 é a forma mais comum de distonia isolada de início precoce e é causada por uma mutação no gene DYT1, a qual resulta na perda de um ácido glutâmico na proteína torsinaA (ΔE-torsinaA). A torsinaA localiza-se no retículo endoplasmático e no invólucro nuclear (IN), enquanto que a ΔE-torsinaA é anormalmente distribuída para o IN. No IN, a torsinaA interage com a proteína 1 associada com a lâmina (LAP1), cuja função ainda não é totalmente conhecida. A LAP1 é uma proteína da membrana interna do núcleo e três isoformas (LAP1A, B e C) desta proteína já foram descritas na literatura. As interações proteína-proteína têm vindo a ser determinantes no estudo de doenças humanas e de sinalização celular. Neste trabalho, foi identificada uma nova interação entre a LAP1B humana e a proteína fosfatase 1 (PP1). A PP1 é uma fosfatase serina/treonina que é responsável pela desfosforilação de cerca de um terço de todas as proteínas em células eucarióticas. A versatilidade da PP1 é possível através da sua ligação a diferentes proteínas reguladoras responsáveis pela sua especificidade e atividade. A LAP1B é desfosforilada pela PP1 e liga-se a esta através de um motivo semelhante ao RVxF que se encontra no seu domínio nucleoplasmático. No decorrer deste trabalho, identificamos também uma nova isoforma da LAP1 humana – LAP1C, que nunca tinha sido descrita em células humanas. A expressão da LAP1B e LAP1C humanas parece ser regulada durante a diferenciação celular e neuronal e são ambas desfosforiladas pela PP1. Além disso, estas proteínas são provavelmente crucias para a manutenção do IN e regulação da mitose. Dado que a PP1 interage com a LAP1 no nucleoplasma e esta interage com a torsinaA no espaço perinuclear, a existência do tricomplexo PP1/LAP1/torsinaA foi validada em cérebro de rato e linhas celulares. A torsinA é desfosforilada pela PP1 mas liga-se a esta, provavelmente, através da LAP1. Dada a localização aberrante da ΔE-torsinaA no IN, é possível que o papel dos complexos formados pela LAP1 no IN e a sua regulação por fosforilação esteja na base da patologia da distonia DYT1. Além disso, a distonia DYT1 tem sido relacionada com uma disfunção nos circuitos dos gânglios de base e da sinalização dopaminérgica. Curiosamente as proteínas PP1 e DARPP-32 desempenham um papel fundamental na sinalização dopaminérgica. Assim, os nossos resultados podem ajudar a compreender os mecanismos moleculares e celulares inerentes à distonia DYT1, onde a fosforilação de proteínas pode desempenhar um papel crucial.