Analysis of the role of ZP3 and APP in cell-cell adhesion

Abstract

Among different types of cell-cell interactions present in the body, the interaction between the oocyte and a sperm cell is of great importance for species perpetuation. Cellular adhesion is thus a crucial process in fertilization, which involves the oocyte’s zona pellucida (ZP), the first barrier found by sperm cells that mediates the first contact between gametes. ZP3 is a major ZP glycoprotein of the oocyte, and its ligand in sperm cells is still unknown. The APP glycoprotein was found by us to be in the sperm’s head, including its equatorial zone involved in sperm-oocyte interaction. This protein plays a role in the pathogenesis of the Alzheimer’s disease and its physiologic roles are still being unravelled. The present work aimed to characterize a putative APP-ZP3 interaction in cell-cell adhesion. Relevant functional motifs on the ZP3 amino acid sequence were analysed, and the role of ZP3 and APP in cell-cell adhesion was evaluated. Interference assays were performed with antibodies against epitopes of APP, ZP3 and β1-integrin, the latter an important protein in cellular adhesion known to bind APP. The subcellular co-localization of ZP3 and APP was analysed by immunocytochemistry assays, and a potential physical interaction between ZP3 and APP was evaluated by immunoprecipitation. Results indicate that, from the studied proteins, APP and β1-integrin are the most important in cell-cell adhesion, probably through a common pathway. ZP3 has only a minor effect in cell-cell adhesion, but is able to interfere with adhesion mediated by APP and β1-integrin, potentially sharing their common pathway. Surprisingly, ZP3 and APP only co-localize at low quantities in vesicles, mainly near the Golgi apparatus, while there is a slightly higher degree of co-localization between ZP3 and β1-integrin near the plasma membrane. Unexpectedly though, ZP3 and APP were found to co-localize in extracellular aggregates of secreted ZP3. Immunoprecipitation results so far further suggest that highly glycosylated ZP3 and APP forms physically interact, what may reflect an important interaction between these proteins in the oocyte’s ZP upon fertilization.

Entre os diversos tipos de interações entre células que ocorrem no organismo, a interação entre o oócito e o espermatozoide é de grande importância para a perpetuação da espécie. A adesão celular é então um processo fundamental para a fertilização, a qual envolve a zona pelúcida (ZP) dos oócitos, a primeira barreira encontrada pelos espermatozoides que medeia a primeira interação entre os gâmetas. A ZP3 é uma das principais proteínas da ZP, e ainda não se conhece qual o seu ligando no espermatozoide. A glicoproteína APP foi descrita por nós como estando presente na cabeça do espermatozoide, em particular na zona equatorial, envolvida na interação espermatozoide-oócito. Esta proteína é central à patogénese da Doença de Alzheimer e os seus papéis fisiológicos ainda não estão bem caracterizados. Este trabalho focou-se na caracterização de um possível interação entre a APP e a ZP3 na adesão célula-célula. Foi realizado um levantamento de motivos funcionais relevantes no ZP3, e avaliado o papel deste e da APP na adesão célula-célula. Para tal foram realizados ensaios de interferência com anticorpos contra epitopos da APP, da ZP3, e também da β1-integrina, um proteína importante na adesão celular e que se sabe ligar à APP. A co-localização subcelular entre a ZP3 e a APP foi analisada por imunocitoquímica, e uma possível interação física entre a ZP3 e APP monitorizada através de ensaios de imunoprecipitação. Os resultados indicam que, de entre as proteínas estudadas, a APP e a β1-integrina são as mais importantes na adesão celular, provavelmente através de uma via comum. A ZP3 parece ter apenas um pequeno efeito na adesão célula-célula, possivelmente através da mesma via da APP e da β1-integrina. Surpreendentemente, ZP3 e APP apresentam pouca co-localização, e especialmente em vesiculas perto do complexo de Golgi. Contudo, existe um maior grau de co-localização entre a ZP3 e a β1-integrina, particularmente perto da membrana plasmática. Inesperada foi também a presença de agregados extracelulares de ZP3 secretada contendo também APP. Os resultados preliminares dos ensaios de imunoprecipitação sugerem uma interacção física entre as formas altamente glicosiladas da APP e da ZP3, o que pode refletir uma importante interação destas duas proteínas na ZP do oócito aquando da fertilização.