Assessing silencing ability of tRNA derived fragments in zebrafish

Abstract

Since their discovery, small non-coding RNAs (sncRNAs) have been implicated in several eukaryotic regulatory mechanisms, such as post-transcriptional gene silencing, chromatin regulation and germline development. Although miRNAs constitute the most studied class of sncRNAs, the advent of high-throughput sequencing technologies allowed the discovery of new classes of sncRNA molecules. Recently, novel sncRNAs derived from tRNAs (tRNA-derived fragments) have been identified, whose biogenesis and functions are not yet well defined. In the last years the RNA laboratory of the Aveiro University has also identified tRNA derived fragments (tRFs) in zebrafish. The abundance of two of these tRFs, namely tRF_3 and tRF_4, which derive from the tRNA 5’-portion – and the fact that both are conserved in vertebrates, processed by Dicer and exhibit some ability to associate with Argonaut proteins, suggest that these fragments represent a novel class of regulatory RNAs that have evolved early in vertebrates and may be involved in ancient mechanisms of genome regulation. Taking this information into account, in this thesis the silencing ability of both tRF_3 and tRF_4 was studied. In order to do that, experiments were performed with a dual reporter system, which allows for the analysis of target regulation by the endogenous molecule. This assay revealed that both fragments have silencing ability, although only tRF_4 has a region whose destabilization inhibits its silencing ability, similarly to miRNAs. Gene target computational predictions for tRF_4 were also performed. The results obtained are related with tRF_4 expression pattern. This thesis shows that tRFs in zebrafish have silencing ability and further studies are required in order to determine, experimentally, their molecular targets.

Desde a sua descoberta que os pequenos RNAs não codificantes (pRNAnc) têm sido implicados em diversos mecanismos de regulação em organismos eucarióticos, nomeadamente no silenciamento génico pós-transcricional, na regulação da cromatina e no desenvolvimento das células germinativas. Apesar dos microRNAs (miRNAs) serem a classe de pRNAnc mais estudada, o desenvolvimento de novas tecnologias de sequenciação permitiu a descoberta de novas classes de pRNAnc. Recentemente foram identificados novos pRNAnc que derivam de tRNAs (fragmentos de tRNA) cujas vias de produção e funções ainda não estão bem definidas. Nos últimos anos, o laboratório de RNA da Universidade de Aveiro identificou fragmentos derivados de tRNAs (tRFs) em peixe zebra. A abundância de dois destes fragmentos - tRF_3 e tRF_4, que derivam da porção 5' de tRNAs maduros – e o facto de ambos serem conservados em vertebrados, processados pela Dicer e apresentarem alguma capacidade de associação com proteínas Argonautas, sugere que estas moléculas representam uma nova classe de RNAs reguladores que evoluíram cedo nos vertebrados e que podem estar envolvidos em mecanismos de regulação pós-transcricional de forma análoga aos miRNAs. Tendo esta informação em consideração, nesta tese estudou-se a capacidade de silenciamento tanto do tRF_3 como do tRF_4. Para isso foram realizadas experiências com um sistema repórter duplo que permite a análise da regulação do gene alvo por moléculas endógenas. Este ensaio revelou que ambos os fragmentos têm capacidade de silenciamento, embora apenas o tRF_4 tenha uma região cuja destabilização inibe a sua capacidade de silenciamento, de forma semelhante aos miRNAs. Foi também realizada a previsão computacional de genes alvo para o tRF_4, sendo que estes se relacionam com o padrão de expressão do tRF_4. Esta tese demonstra que os tRFs em peixe zebra possuem capacidade de silenciamento e estudos futuros são necessários para determinar experimentalmente os seus alvos moleculares.