Unraveling the APP/HB-EGF interaction

Abstract

Alzheimer’s disease (AD) is the most prevalent neurodegenerative disorder worldwide and the leading cause of dementia in the elderly. Abnormal processing of Alzheimer’s amyloid precursor protein (APP) and increased generation of its amyloid beta (Aβ) fragment are central events in the AD pathogenesis, propelling major studies on APP biology. APP is thought to be involved in important processes such as cell adhesion, survival, migration and differentiation. Therefore, because of the imperative need to study APP biological functions, the search for APP-binding partners has stand out. Recently in our laboratory, a plethora of putative APP-binding proteins was unraveled through the use of the Yeast Two Hybrid (YTH) system. Among them, the heparin-binding epidermal growth factor-like growth factor (HB-EGF) has emerged as an interesting target of study. HB-EGF is a heparin-binding member of the EGF family of growth factors that stimulates growth and differentiation. It has been purposed has an important trophic factor in the developing and adult central nervous system (CNS), being expressed at much higher levels than EGF in the CNS, which indicates that HB-EGF may serve as a major ligand for EGFR in neurons. HB-EGF is synthesized as a pre-pro-form of 208 amino acids in length and is expressed at the cell surface as a 20-30kDa type I transmembrane precursor, named proHB-EGF. This larger membrane-anchored precursor is then proteolytically processed, generating the mature soluble HB-EGF (sHB-EGF) that is released to the extracellular medium. Very interestingly, HB-EGF presents autocrine, paracrine and juxtacrine biological activities, with proHB-EGF evidencing unique biological characteristics distinct from sHB-EGF. In the work here described, we first validated the APP/HB-EGF interaction by yeast co-transformation, and unraveled that the interaction is not mediated by the APP intracellular domain (AICD). We further confirmed it as an in vivo interaction by GFP-Trap pull-down assays and accessed the physiological relevance of this novel interaction through co-localization and signaling studies in HeLa cells transfected with the APP-GFP and HB-EGF cDNAs. Although the functional role of the APP/HB-EGF complex was not determined, results suggest that these proteins physically and functionally interact, having potential value in regulating each other signal pathways, with a role for APP in inducing the activation of the MAPK signaling being evidenced. In addition, a putative novel interaction with a proEGF species was also detected and APP was shown to act synergistically with EGF to activate the MAPK signaling. These results deepen our understanding of the APP biology, a crucial protein in cerebral physiology and AD pathophysiology.

A Doença de Alzheimer (DA) é a doença neurodegenerativa mais prevalente a nível mundial, e a principal causa de demência na população sénior. O processamento anormal da Proteína Precursora de Amilóide de Alzheimer (PPA) e a produção aumentada do seu fragmento beta amilóide (Aβ) constituem eventos centrais na patogénese da DA, o que tem fomentado a investigação da PPA. Esta tem sido descrita como uma proteína envolvida em processos celulares determinantes, como adesão, migração, diferenciação, e sobrevivência celular. Como tal, devido à necessidade imperativa de caracterizar as suas funções biológicas, a investigação de proteínas que interagem com a PPA é de vital importância. Recentemente, diversas proteínas foram identificadas no nosso laboratório como putativos interatores da PPA, através da técnica de Yeast Two Hybrid (YTH). De entre estes, o fator de crescimento de ligação à heparina semelhante ao fator de crescimento epidermal (HB-EGF) revelou-se um interessante alvo de estudo. O HB-EGF é um membro da família do fator de crescimento epidermal (EGF) com capacidade de ligação à heparina, que se destaca pelas suas capacidades de estimular o crescimento e diferenciação celulares, tendo sido proposto como um relevante fator trófico para o desenvolvimento e manutenção do sistema nervoso central (SNC). Na verdade, o HB-EGF é mais abundante no SNC do que o próprio EGF, o que sugere que o HB-EGF é o principal ligando neuronal para o recetor do EGF (EGFR). O HB-EGF é sintetizado como um precursor de 208 aminoácidos (pre-proHB-EGF), sendo exposto na membrana celular como um precursor transmembranar de 20-30 kDa, o proHB-EGF. Esta forma é subsequentemente proteoliticamente processada, gerando um péptido solúvel que é libertado para o meio extracelular (sHB-EGF). Curiosamente, o HB-EGF apresenta atividades biológicas parácrinas, autócrinas e justácrinas. O presente trabalho teve como principal objetivo a validação da interação entre a PPA e o HB-EGF, primeiramente alcançado através da técnica de YTH, que revelou também que a interação entre as duas proteínas não é mediada pelo domínio intracelular da PPA. Esta interação foi subsequentemente confirmada por ensaios de GFP-Trap pull-down em cultura de células de mamífero, e a sua relevância fisiológica estudada através de estudos de co-localização e sinalização celulares, usando células HeLa transfectadas com os cDNAs da PPA e do HB-EGF. Apesar do papel funcional do complexo PPA/HB-EGF não ter sido determinado, os resultados obtidos sugerem que as duas proteínas interagem física e funcionalmente, influenciando a sinalização mediada por cada uma delas separadamente, como a ativação da via de sinalização MAPK que verificámos ser também induzida pela PPA. Adicionalmente, descrevemos uma nova interação proteica entre a PPA e uma forma precursora do EGF, e demonstrámos que a PPA atua de forma sinérgica com o EGF. Estes resultados levam a uma maior compreensão da biologia da PPA, uma proteína importante na fisiologia cerebral e na fisiopatologia da DA.