Knocking-down LAP1 using the short hairpin RNA strategy

Abstract

A proteína 1B associada com a lâmina é uma proteína intrínseca da membrana interna nuclear que está abundantemente expressa nos tecidos neuronais, nomeadamente no estriado, tronco cerebral e cerebelo. A LAP1 está associada com a lâmina nuclear e pensa-se que estabiliza a arquitetura do invólucro nuclear (NE). A função da LAP1B ainda não é compreendida, mas pensa-se que serve de local de ligação entre a lâmina e a membrana interna nuclear. Além disso, a LAP1 pode estar também envolvida na organização dos microtúbulos do fuso mitótico durante a mitose. Uma vez que a função da LAP1 não é conhecida, induziu-se o knockdown em células de neuroblastoma humanas através da estratégia de RNA de interferência pela variante short hairpin, para mimetizar o comportamento da célula na ausência da LAP1. Através de immunoblotting e de microscopia de fluorescência, confirmou-se a diminuição dos níveis da LAP1B, assim como da LAP1C, uma isoforma ainda não sequenciada até ao momento. Novamente, por immunoblotting, os níveis intracelulares da lâminaB1, α-tubulina acetilada e da Polimerase poli ADPRibose (PARP) foram avaliados por uma análise global da integridade celular. Por microscopia confocal, a morfologia dos núcleos celulares e a distribuição da α-tubulina acetilada foram observados para analisar a integridade do invólucro nuclear. Os nossos dados sugerem que a LAP1B parece ser essencial para a distribuição da α-tubulina acetilada e, consequentemente, para a estabilidade dos microtúbulos durante a mitose. Existem evidências que a outra isoforma parece desempenhar um papel mais importante na morfologia e integridade do invólucro nuclear. Ambas as isoformas parecem desempenhar um papel essencial na regulação da mitose. Contudo, são necessários estudos adicionais para confirmar estes resultados e desvendar a função específica das isoformas da LAP1 durante a mitose.

Lamina-Associated Polypeptide 1 (LAP1) is a type two integral inner nuclear membrane (INM) protein that is abundantly expressed in neural tissues, namely striatum, mid-brain and cerebellum. LAP1 protein is associated with nuclear lamina, which is thought to stabilize the nuclear envelope (NE) architecture. The function of LAP1 protein is not already understood but it is thought to function as a lamina attachment site into the inner nuclear membrane (INM). Additionally, LAP1 may also be involved in assembly of mitotic microtubule spindle during mitosis. Since the function of LAP1 remains unknown, we induced the knockdown of LAP1, in human neuroblastoma cells, through the short hairpin RNA interference strategy, in order to mimic the cellular behavior in the absence of LAP1. Through immunoblotting and fluorescence microscopy, we confirmed the decrease of intracellular levels of LAP1B as well as in another isoform not sequenced so far. Once more, through immunoblotting, the levels of laminB1, acetylated α-tubulin and cleaved poly ADP-Ribose Polymerase (PARP) were evaluated for an overall analysis of cellular integrity. By confocal microscopy, cell nuclei morphology and acetylated α-tubulin distribution were observed to analyze the nuclear envelope integrity. Our data suggest LAP1B seems to be essential for acetylated α-tubulin distribution and, therefore, for microtubule stability during mitosis. There is evidence that the other isoform seems to play a more pronounced role in nuclear envelope integrity and morphology. Together, both isoforms seem to play an essential role in mitosis regulation. However, further studies are required to confirm these results and unravel the specific function of LAP1 isoforms during mitosis.