Identifying chemoresistance targets in putative lung cancer stem cells

Abstract

A resistência tumoral é o maior problema relacionado com a eficácia do tratamento de cancro de pulmão, tipo de cancro com a maior taxa de mortalidade a nível mundial. Atualmente, acredita-se que uma subpopulação de células tumorais, as células estaminais cancerígenas (CECs) que possuem capacidade de autorrenovação e capacidade de sustentar o crescimento tumoral, seja parcialmente responsável pela resistência tumoral face à terapia. De facto, CECs pulmonares isoladas de tumores de pacientes com cancro de pulmão revelaram-se particularmente químio-resistentes. Embora os mecanismos subjacentes à resistência não serem completamente compreendidos, a sobre-expressão de bombas de efluxo, de proteínas anti-apoptóticas e alta eficiência na reparação do ADN parecem fazer parte das propriedades das CECs responsáveis pela resistência aos agentes químio-terapêuticos. É pretendido, neste projeto, isolar e caracterizar populações de CECs pulmonares e, tendo em conta os seus mecanismos de resistência, identificar possíveis alvos terapêuticos de forma a sensibilizá-las aos fármacos atualmente utilizados clinicamente. Linhas celulares pulmonares cancerígenas (NCI-H460, A549) foram incubadas com os fármacos cisplatina ou doxorrubicina durante três semanas, seguindo-se um período de recuperação, para isolar uma possível população de CECs. Durante este período, a morfologia celular foi acompanhada e registada. Para medir o efeito de fármacos foram feitos ensaios de crescimento/viabilidade celular (ensaio à base de resazurina e ensaio de sulforodamina B) tanto nas células parentais como nas selecionadas. Realizou-se, ainda, qRT-PCR e Western blot para averiguar a existência de possíveis mecanismos de resistência nas células selecionadas. Utilizou-se citometria de fluxo e qRT-PCR para procurar marcadores de estaminalidade (como, ABCG2 e Sox2) e o ensaio de formação de colónias para verificar o enriquecimento de CECs após uma exposição prolongada aos fármacos. A exposição aos fármacos levou a uma alteração temporária da morfologia celular, onde as células apareceram com uma estrutura do tipo mesenquimal. A exposição à cisplatina conduziu a um aumento na capacidade das células NCI-H460 resistirem tanto ao agente de seleção como à gencitabina e à doxorrubicina, contudo o mesmo não se verificou em relação ao 5-FU. Após o tratamento com cisplatina, registou-se um aumento das proteínas anti-apoptóticas, Bcl-XL e XIAP, e da glicoproteína-P, em comparação com as células NCI-H460 parentais. Houve um ligeiro aumento na percentagem de células a expressar ABCG2 e, com menor intensidade, CD133. Relativamente à expressão génica do Bmi-1 e do Sox2, não foi registado nenhum aumento de expressão após o contacto com cisplatina. As células resistentes não demonstraram mais capacidade para formar colónias que as células parentais. Possivelmente, o aumento da resistência das células após o tratamento com cisplatina deve-se ao aumento de expressão das proteínas Bcl-XL, XIAP e glicoproteína-P. Como trabalho futuro ir-se-á silenciar estas proteínas através de iRNAs, numa tentativa de sensibilizar as células resistentes e validar, assim, estas moléculas como possíveis alvos terapêuticos para ultrapassar a resistência das células pulmonares cancerígenas à quimioterapia.

Tumour drug resistance is a major issue in the management of lung cancer, the worldwide leading cause of cancer-related deaths. It is currently believed that a small sub-population of tumour cells, the cancer stem cells (CSCs) that possess self-renewal capacity and are able to sustain tumour growth, are partially responsible for tumour drug resistance. Indeed lung CSCs isolated from patients’ tumours have been shown to be particularly chemoresistant. Although the mechanisms underlying this resistance are not fully understood, over-expression of efflux pumps, over-expression of anti-apoptotic proteins and efficient DNA repair seem to be involved in resistance of CSCs to chemotherapeutic agents. In this project we aim to isolate and characterize putative lung CSC populations taking into account the chemoresistance mechanisms of these cells and to identify potential therapeutic targets to render them more sensitive to the chemotherapeutic drugs used in the clinic. Lung cancer cells (NCI-H460, A549) were incubated with the drugs cisplatin or doxorubicin, for three weeks followed by a drug-free recovery period, in order to isolate a putative CSC enriched population. Cell morphology was monitored and recorded throughout the experiment. Drug-selected and parental cells were incubated with chemotherapeutic agents and multiwell based cell growth/viability assays (resazurin-based and SRB assays) were performed. Western Blot and qRT-PCR were performed to identify possible chemoresistance mechanisms present in the putative CSC enriched populations. Flow cytometry analysis and qRT-PCR for stem cell markers (e.g. ABCG2 and Sox2) and colony-forming assay were performed in order to assess enrichment of putative CSCs upon prolonged drug exposure. Drug treatment led to a transient alteration in cell morphology in both cell lines, whereby cells acquired a more mesenchymal-like structure. In NCI-H460 cells, cisplatin exposure led to increased resistance towards the selecting drug but also to doxorubicin and gemcitabine, although not for 5-FU. Increased expression of the apoptosis-related proteins Bcl-XL and XIAP and of the drug efflux pump P-glycoprotein was verified in the cisplatin-selected population, when compared to the parental NCI-H460 cell line. There was an apparent increase in the percentage of cells expressing the putative stem cell marker ABCG2, and to a much lesser extent CD133, upon drug treatment. Bmi-1 and Sox2 gene expression do not appeared to be up-regulated in selected cells and colony-forming assay did not show any differences between NCI-H460 parental and resistant cells. The verified increased drug resistance after cisplatin treatment is possibly due to overexpression of Bcl-XL, XIAP and P-glycoprotein. We will now perform RNAi approaches to inhibit the combined expression of these proteins, in an attempt to chemosensitize resistant cells and to validate these molecules as therapeutic targets for overcoming chemoresistance in lung cancer cells.