Identificação de determinantes de resistência em P. falciparum

Abstract

O presente estudo teve como objetivo a análise de possíveis determinantes de resistência por parte do Plasmodium falciparum ao fármaco antimalarico mefloquina. Para tal foi utilizada a estirpe W2, resistente à cloroquina e sensível à mefloquina, e uma estirpe isogénica W2mef, derivada de W2 e obtida por pressão seletiva em meio rico em mefloquina. Procedeu-se a um fracionamento subcelular e analisaram-se os extractos obtidos, com recurso a marcação com isótopos, O18 e iTRAQ, seguida de LC MS/MS MALDI, tendo sido identificadas 248 proteínas, sendo 76 de P. falciparum e 172 de Homo sapiens. Verificaram-se alterações na expressão proteómica de 10 proteínas de P. falciparum e 7 de Homo sapiens. A análise da atividade proteolítica por zimografia, revelou a diferenças relevantes de atividade proteásica nas amostras de W2mef, tendo sido identificada a aminopeptidase, “M1 family aminopeptidase”. Através dos resultados a atividade proteolítica em conjugação com análise bioinformática verificou-se que a protease identificada, tem um papel relevante na via de degradação da hemoglobina, estabelecendo interações indiretas com proteínas que se sabe estarem envolvidas no processo de obtenção de a.a., fundamental para a sobrevivência e desenvolvimento parasitário. Em suma as significativas diferenças de atividade proteolítica das amostras com a estirpe resistente e o facto da “M1 family aminopeptidase” estar associada a um processo vital para o desenvolvimento do parasita, faz com que esta protease possa ser apontada como o novo determinante para o desenvolvimento de novos fármacos, nomeadamente baseados em inibidores da PfA-M1.

The aim of the present study was to analyze resistance determinants of Plasmodium falciparum to the mefloquine antimalarial drug. With this propose was used a W2 strain, known to be chloroquine resistant and mefloquine sensitive, and a isogenic W2mef strain, derived from W2 and obtained by selective pressure on a mefloquine rich medium. Parasatic proteins were extracted with a optimized and aggressive extraction buffer, follow of cellular fractionation and ultracentrifuge. The protein profile of the samples was analyzed using labeling with O18 and iTRAQ, followed by LC MS/MS MALDI. Were identified 248 proteins, 76 of P. falciparum and 172 of Homo sapiens and has been identifying changes in the expression of 10 parasitic and 7 human proteins. The proteolytic activity analysis by zimography reveals significant differences in protease activity in the samples of W2mef, and has been identified an aminopeptidase, the “M1 family aminopeptidase”. Through the results of the proteolytic activity in conjuction with bioinformatics analysis reveals that the identified protease, plays a central role in the hemoglobin degradation pathway, establishing indirect interactions with proteins known to be involved in the obtaining of a.a., which is fundamental to parasite survival and development. In conclusion, the significant proteolytic activity differences of resistant strain samples and the fact that “M1 family aminopeptidase” is being associated with a vital process to the parasite development, makes this protease, the new possible determinant for the development of new drugs, in particular, based in PfA-M1 inhibitors.