Genetic characterization of NAD biosynthesis enzymes in human tumor cell lines

Abstract

Nicotinamida Adenina Dinucleótido (NAD) é um importante cofator nas reações metabólicas, sendo um substrato para as enzimas consumidoras de NAD, como as PARPs e as Sirtuinas. A via de síntese do NAD processa-se pela via de novo, na qual o NAD é sintetizado através do triptofano e do aspartato, e a via de reciclagem, onde o NAD pode ser reciclado a partir de diferentes precursores. As células cancerígenas têm necessidades aumentadas de NAD, pelo que inibidores da nicotinamida fosforibosiltransferase (NAMPT), a enzima mais importante na via de reciclagem do NAD nos humanos, estão em testes clínicos como agentes terapêuticos para o cancro. Contudo, apesar de serem agentes promissores, apresentam alguma citotoxicidade que pode ser ultrapassada pela adição de ácido nicotínico (NA) que vai ativar o ácido nicotínico fosforibosiltransferase (NAPRT) como via alternativa de síntese do NAD. Contudo, existe pouca informação acerca dos padrões de expressão do NAPRT, apesar de que é um biomarcador para a utilização do ácido nicotínico no tratamento com inibidores do NAMPT. Assim, o grande objetivo deste trabalho é caracterizar as duas enzimas mais importantes da via de reciclagem do NAD, NAMPT e NAPRT, em linhas celulares tumorais humanas, integrando informação obtida através do ADN, ARN e proteína. Foram pesquisadas mutações e diferenças de expressão, sendo também feita a análise da estrutura 3D da proteína NAMPTlike, destacando três substituições de aminoácidos.

Nicotinamide Adenine Dinucleotide (NAD) is a major cofactor in metabolic reactions, and is also the substrate of NAD-consuming enzymes such as PARPs and Sirtuins. NAD biosynthesis occurs via the de novo pathways, in which NAD is synthesized from tryptophan or aspartate, and the salvage pathways, where NAD can be recycled from several different precursors. Cancer cells have increased NAD requirements, thus inhibitors of nicotinamide phosphoribosyltransferase (NAMPT), the main human NAD salvage enzyme, are currently in clinical trials as novel cancer therapeutic agents. The citotoxicity presented by these inhibitors can be decreased by the use of nicotinic acid (NA) that will activate nicotinic acid phosphoribosyltransferase (NAPRT) as an alternative NAD synthesis pathway. Thus, the expression of NAPRT is a biomarker for the use of nicotinic acid as a chemoprotector in treatment with NAMPT inhibitors, however, few studies have addressed NAPRT expression in tumors. So the main goal of this work was to characterize the two main enzymes involved in the NAD salvage pathways, NAMPT and NAPRT, in human tumor cell lines, by integrating data obtained from the three levels of biological information – DNA, RNA and proteins. Mutations and differences in expression levels were pursued and the analysis of the 3D structure of the NAMPT-like protein was also a goal, highlighting the impact of three amino acid substitutions.