APP phosphorylation on APP/Gαo colocalization and STAT3 activation

Abstract

A proteína Gαo é uma das subunidades alfa da família das proteínas G heterotriméricas, proteínas envolvidas na transdução de sinais a partir recetores membranares. Gαo é principalmente expressa nos neurónios, encontrando-se localizada ao longo da membrana plasmática, incluindo nos cones de crescimento dos neurónios, onde também se encontra a Proteína Precursora de Amilóide de Alzheimer (PPA), uma proteína membranar com um papel central na doença de Alzheimer. Algumas funções semelhantes já foram atribuídas às duas proteínas, incluindo papéis na diferenciação e migração celular. A ligação da PPA à Gαo já foi descrita, o que pode indicar que a PPA modula as suas funções através da ligação e ativação da Gαo. Também já foi demonstrado que uma das vias pela qual a Gαo leva à neuritogénese é a ativação do transdutor de sinal e ativador da transcrição 3 (STAT3). A Gαo ligase ao domínio C-terminal da PPA, nos aminoácidos His657-Lis676, que pertencem a uma região hidrofóbica imediatamente a jusante do sorting motif 653YTSI656. Isto leva a crer que a ligação entre a PPA e a Gαo pode ser mediada pela fosforilação da PPA no resíduo Serina 655 (S655). Assim, a fosforilação da PPA poderia influenciar a ativação da Gαo e consequente sinalização via STAT3. Neste trabalho, nós estudámos os efeitos da fosforilação da PPA e ativação da Gαo na interação funcional da PPA/Gαo. Isto foi analisado por cotransfeção de células de neuroblastoma humano não diferenciadas (SH-SY5Y) com PPAGFP selvagem ou fosfomutante (PPA com a S655 constutivamente fosforilada ou desfosforilada) e com a Gαo selvagem ou Gαo constutivamente ativa. As células foram sujeitas a ensaios de imunofluorescência e vários parâmetros foram analisados, tais como a colocalização subcelular da PPA e da Gαo, o número de prolongamentos celulares e o seu comprimento, e a intensidade da STAT3 no núcleo. Toda a análise quantitativa feita nas microfotografias foi realizada no software Fiji (ImageJ). Ensaios de Western Blot também foram realizados para avaliar a influência da co-expressão da PPA e Gαo em proteínas do citoesqueleto. Os nossos resultados mostram que a Gαo e a PPA parecem colocalizar principalmente no aparelho de Golgi e nos prolongamentos celulares. Ambas as proteínas parecem cooperar entre si e induzir alterações neuritogénicas, com a Gαo a levar principalmente a uma formação inicial dos prolongamentos e a PPA a atuar na extensão dos mesmos, num modo dependente da fosforilação da S655. Além disso, observou-se que a PPA diminui a ativação da STAT3 induzida pela Gαo, devido provavelmente a um efeito de retroinibição. Estes resultados provam que estas proteínas interagem funcionalmente e o seu potencial valor em aplicações neuritogénicas terapêuticas será estudado em maior detalhe.

The Gαo protein is an alpha subunit of the heterotrimeric G proteins, a protein family vastly involved in signal transduction from membranar receptors. Gαo is enriched in the plasma membrane of neurons, including neurons growth cone, together with the Alzheimerʼs amyloid precursor protein (APP), a transmembranar protein with a central role in Alzheimer's Disease. A few similar functions have been attributed to both proteins, such as roles in cell differentiation and migration. APP binding to Gαo has been reported, which could indicate that APP modulates its functions by binding and activating Gαo. Further, one of the pathways by which Gαo leads to neurite outgrowth is by activation of the signal transducer and activator of transcription 3 (STAT3). Gαo binds to the APP C-terminal domain, namely at amino acids His657-Lys676, which belong to a hydrophobic pocket localized immediately downstream the APP 653YTSI656 basolateral sorting motif. Therefore, APP binding to Gαo may be potentially mediated by APP phosphorylation at the Serine 655 residue (S655), and thus APP phosphorylation could influence Gαo activation and STAT3 signalling. In this work we have studied the effects of APP phosphorylation and Gαo activation in Gαo/APP functional interactions. This was analysed by cotransfecting human non-differentiated neuroblastoma (SH-SY5Y) cells with either Wt or phosphomutants of APP-GFP (APP with either a constitutively phosphorylated or dephosphorylated S655) and Gαo or a constitutively active Gαo cDNA. Cells were subjected to immnofluorescence assays, and several parameters analysed, such as the subcellular colocalization of Gαo and APP, the number of cellular projections and their length, and nuclear STAT3 intensity. Every quantitative analysis done upon microphotographs was performed using the Fiji (ImageJ) software. Western blot assays were also performed to evaluate the influence of APP and Gαo co-expression in cytoskeleton-related proteins. Our results show that Gαo and APP appear to colocalize mainly in the Golgi apparatus and in cellular projections. Both proteins appear to cooperate with each other and induce neuritogenic changes, with Gαo mainly driving an initial formation of cellular projections and APP influencing their elongation, in an APP S655 phosphorylation-dependent manner. Moreover, APP was observed to decrease Gαo-induced STAT3 activation, probably by a retro-inhibition effect upon earlier STAT3 activation. These results prove that these proteins functionally interact, and their potential value in neuritogenic therapeutic applications will be further studied.