Extraction and purification of triterpenic acids from eucalypt bark

Abstract

A indústria da pasta e do papel é um sector importante da economia mundial, particularmente a que assenta em espécies de Eucalyptus. No entanto, essas indústrias geram quantidades significativas de correntes secundárias de subprodutos e resíduos de biomassa que podem ser exploradas em aplicações de valor acrescentado em vez de serem queimadas para produção de energia. Um exemplo nobre pode ser a produção de ácidos triterpénicos com estruturas dos tipos lupano, oleanano e ursano, dada a sua abundância em alguns destes resíduos, em particular na casca, adotando o conceito de biorrefinaria integrada numa fábrica de pasta. Estes compostos são conhecidos pelas suas inúmeras actividades biológicas, por exemplo, antioxidante, anti-inflamatória e antitumoral, e podem encontrar aplicações em produtos de elevado valor, tais como cosméticos, nutracêuticos ou farmacêuticos. Neste sentido, o estudo das potencialidades das cascas das espécies de eucalipto mais exploradas enquanto fontes de compostos triterpénicos é um tópico relevante. Por conseguinte, foram analisados e comparados em pormenor os teores e composições em ácidos triterpénicos (TTAs) das cascas externas de várias espécies de eucalipto (E. globulus, E. grandis, E. urograndis, E. maidenii e E. nitens). Os teores dos principais TTAs identificados nestas espécies variaram entre 4.5 g/kg no E. urograndis e 21.6 g/kg no E. nitens. Observou-se que as cascas externas de Eucalyptus de zonas temperadas e Mediterrânicas, nomeadamente E. nitens e E. globulus, são mais ricas em TTAs que as espécies de regiões tropicais e subtropicais. Além disso, a casca externa do E. globulus é claramente a mais rica em ácidos com estruturas do tipo ursano enquanto a do E. nitens é a mais rica em ácidos do tipo oleanano e lupano. Estes resultados levaram-nos a estudar a extração dos TTAs da casca de Eucalyptus, bem como a sua posterior concentração e purificação, a qual foi efetuada por extração sólido-líquido convencional combinada com a precipitação de solutos, e por extração com fluidos supercríticos (SFE). No que diz respeito à primeira abordagem referida, foi desenvolvido neste trabalho um método patenteado que permite obter extratos enriquecidos em TTAs das cascas de eucalipto baseado em tecnologias disponíveis no imediato. Em relação à segunda abordagem, e de forma a apostar em processos de baixo impacto ambiental exigidos pelas biorrefinarias do futuro, a SFE surge como uma opção natural. Assim, foi efetuada a SFE da casca caduca do E. globulus com dióxido de carbono puro e modificado para recuperar a fração de TTAs, e os resultados foram comparados com os obtidos por extração em Soxhlet com diclorometano. Foram realizados estudos preliminares sobre a influência da pressão (100-200 bar), a adição de co-solvente (0, 5 e 8% m/m de etanol), e operação em múltiplos passos a fim de avaliar a aplicabilidade da alternativa supercrítica para a sua produção eficiente e selectiva. Os resultados destacaram a influência da pressão e o importante papel resumo (cont.) desempenhado pelo co-solvente neste processo, cujo efeito foi mais relevante do que o aumento da pressão em várias dezenas de bar. Este trabalho foi depois otimizado, usando o planeamento factorial de experiências e a metodologia de superfícies de resposta, para analisar a influência da temperatura (40-60 ºC), pressão (100-200 bar), e teor de etanol (0.0-5.0% m/m) na recuperação dos TTAs e respectiva concentração nos extractos. Nestes intervalos, as melhores condições de operação encontradas foram 200 bar, 40 °C e 5% de etanol, para as quais os modelos de regressão estatisticamente validados previram um rendimento de extração de 1.2% com 50% de concentração em TTAs, correspondendo ao rendimento em TTAs de 5.1 g/kg de casca e uma recuperação de 79.2% comparativamente ao valor do Soxhlet. Os TTAs livres e acetilados apresentaram tendências de extracção bastante distintas devido às suas diferentes afinidades para o CO2 causadas pelas diferentes polaridades: os derivados acetilados aproximam-se de um patamar máximo a cerca de 200 bar e 5% de etanol, enquanto a extração dos TTAs livres apresenta uma tendência sempre crescente no intervalo de condições estudado. Foram também medidas curvas cumulativas de SFE da casca do E. globulus de forma a analisar o comportamento cinético do processo em termos de rendimento total, rendimento em TTAs, rendimento em TTAs livres, rendimento em TTAs acetilados, e concentração dos TTAs nos extractos. Foi analisada a influência da pressão, temperatura, teor de co-solvente e caudal do dióxido de carbono sobre as respostas anteriores. Os dados experimentais foram modelados com os modelos Logístico, de Dessorção, de Placa Plana Simples, e de Difusão. Na globalidade, os resultados confirmaram que a pressão e o teor de etanol têm um efeito significativo sobre as curvas de extração, os rendimentos finais e as concentrações dos extratos, e mostraram a presença de limitações externas à transferência de massa em alguns ensaios. Mais uma vez, as famílias individuais de TTAs livres e acetilados apresentaram diferentes tendências de extracção. A modelação permitiu-nos confirmar não só o importante papel desempenhado pela difusão intraparticular na SFE, mas também a contribuição da resistência no filme em alguns ensaios. Após a análise de todos os resultados, foi efetuado um ensaio em duas etapas em série, possibilitando o enriquecimento do teor em TTAs no extracto devido às diferentes condições adotadas em cada etapa. Por último, um éster metílico de um ácido triterpénico do tipo oleanano - morolato de metilo - foi identificado pela primeira vez enquanto componente da casca de Eucalyptus na casca externa do Eucalyptus grandis x globulus, onde ocorre em teores elevados. A sua extração com CO2 supercrítico foi também realizada, visando a conceção de uma alternativa de extração ambientalmente benigna para este composto. A 200 bar e 60 ºC, a remoção do morolato de metilo atingiu um patamar às 6 h para 5.1 kg h-1 de CO2 / kg de casca. Em geral, e de forma semelhante à SFE da casca do E. globulus, os TTAs acetilados foram mais significativamente extraídos quando comparados com os seus ácidos livres, o que está diretamente relacionado com a natureza menos polar destas moléculas. O trabalho apresentado nesta tese é uma contribuição para a valorização de uma corrente de biomassa com baixo valor na indústria de pasta em duas vertentes complementares. Por um lado, aumentou o conhecimento da composição lipofílica das cascas de Eucalyptus spp. com interesse comercial para a produção de pasta, destacando o seu potencial enquanto fontes de ácidos triterpénicos. Por outro lado, foram desenvolvidos dois processos alternativos e facilmente integráveis numa fábrica de pasta para a sua exploração a partir da casca: um baseado em tecnologias convencionais bem estabelecidas a nível industrial, prevendo a sua aplicação a curto prazo, e um outro baseado na SFE, seguindo as tendências das futuras biorrefinarias.

The pulp and paper industries are an important sector in the world economy, particularly those based on Eucalyptus species. However these industries generate substantial amounts of by-products and biomass side streams which may be exploited in added value applications, rather than being burned for energy production. A noble example could be the production of triterpenic acids with lupane, oleanane, and ursane skeletons, by adopting the concept of a biorefinery integrated into a pulp mill, since they are highly abundant in some of those residues, particularly in the bark. These compounds are known by their innumerous biological properties, e.g. antioxidant, anti-inflammatory or antitumor, and can find valuable applications in products such as nutraceuticals, cosmetics or pharmaceuticals. In this sense, the study of the potentialities of the barks of the most exploited Eucalyptus species as sources of triterpenic compounds is an important issue. Accordingly, the analysis of the triterpenic acids (TTAs) composition of the outer barks of several Eucalyptus species (E. globulus, E. grandis, E. urograndis, E. maidenii and E. nitens) was carried and compared in detail. The contents of the main TTAs identified in these species varied between 4.5 g/kg in E. urograndis and 21.6 g/kg in E. nitens. It was observed that the outer barks from Eucalyptus of temperate and Mediterranean zones, namely E. nitens and E. globulus, are richer in TTAs than those species from sub-tropical and tropical regions. Furthermore, E. globulus outer bark is clearly the richest in ursane acids while E. nitens is the richest in oleanane and lupane acids. These results induced us to investigate the TTAs extraction from Eucalyptus bark and their further concentration and purification, which were accomplished by conventional solid-liquid extraction combined with solutes precipitation, and by supercritical fluid extraction (SFE). With respect to the first mentioned approach, a patented method for obtaining extracts enriched in TTAs from Eucalyptus barks based on readily available technologies was developed in this work. Concerning the second approach, in order to contribute for the low environmental impact processes required by future biorefineries, the SFE arises as a natural option. Hence, the SFE of E. globulus deciduous bark was performed with pure and modified carbon dioxide to recover the TTAs fraction, and the results were compared with those obtained by Soxhlet extraction with dichloromethane. The influence of pressure (100-200 bar), co-solvent content (0, 5 and 8 wt.% of ethanol), and multistep operation were preliminary studied in order to evaluate the applicability of the supercritical alternative for their selective and efficient production. Results pointed out the influence of pressure and the important role played by co-solvent, whose effect was more important than increasing pressure by several tens of bar. This work was further optimized using factorial design of experiments and the response surface abstract (cont.) methodology to analyze the influence of temperature (40-60 ºC), pressure (100- 200 bar), and ethanol content (0.0-5.0 wt.%) upon TTAs recovery and concentration in extracts. In these intervals, the best operating conditions found were 200 bar, 40ºC and 5% ethanol, for which the statistically validated regression models provided an extraction yield of 1.2% and TTAs concentration of 50%, which correspond to TTAs yield of 5.1 g/kg of bark and a recovery of 79.2% in comparison to the Soxhlet value. The trends of the free and acetylated TTAs were very different, due to their distinct CO2-philic character caused by dissimilar polarities: the acetyl derivatives approached a plateau near 200 bar and 5% ethanol, while the free TTAs extraction always increased in the range of the conditions studied. The cumulative curves of SFE of E. globulus bark were also measured in order to examine the kinetic behavior of this process in terms of total yield, TTAs yield, free TTAs yield, acetylated TTAs yield, and TTAs concentration in the extracts. The influence of pressure, temperature, co-solvent content, and carbon dioxide flow rate upon the previous responses was analyzed. The experimental curves were modeled with Logistic, Desorption, Simple Single Plate, and Diffusion models. In the whole, results confirmed that pressure and ethanol content imparted a significant effect upon extraction curves, final yields, and extracts concentrations, and showed that external limitations to mass transfer affected some runs. Once again, the individual families of free and acetylated TTAs exhibited distinct extraction trends. Modeling allowed us to confirm not only the major role played by intraparticle diffusion upon the SFE but also the contribution of film resistance in some assays. After analyzing all results, a two-step experiment in series has been performed, making possible to enrich the TTAs content in the extract due to the distinct conditions adopted in each stage. Finally, a highly abundant oleanane type triterpenic acid methyl ester – the methyl morolate – was identified for the first time as a component of Eucalyptus bark tissues in outer barks of Eucalyptus grandis x globulus. Its supercritical CO2 extraction was also carried out, aiming at designing an environmentally friendly extraction alternative for this compound. At 200 bar and 60 ºC, the methyl morolate removal attained a plateau at 6 h for 5.1 kg h-1 of CO2 / kg of bark. In the whole, and similarly to the SFE of E. globulus bark, the acetylated TTAs obtained were more significantly extracted when compared to their free acids, which is directly related with the less polar nature of the former molecules. The work presented in this thesis is a contribution for the upgrading of a low value biomass stream from the pulp industry from two complementary points of view. In one hand, it increased the knowledge of the lipophilic composition of the bark of Eucalyptus spp. with commercial interest for pulpwood, highlighting their potential as triterpenic acids sources. On the other hand, two alternative processes were developed for their exploitation from the bark, being easily integrated within a pulp mill: one based on well establish conventional technologies foreseeing its short term implementation, and another based on SFE, following the trends of future biorefineries.