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 Determinant factors for the use of imposex in TBT pollution monitoring
Please use this identifier to cite or link to this item http://hdl.handle.net/10773/971

title: Determinant factors for the use of imposex in TBT pollution monitoring
authors: Oliveira, Susana Galante Correia Pinto de
advisors: Barroso, Carlos Miguel Miguez
Pacheco, Mário Guilherme Garcês
keywords: Biologia
Poluição marinha
Indicadores biológicos
Gastrópodes
Ecotoxicologia
issue date: 2010
publisher: Universidade de Aveiro
abstract: Os compostos de tributilestanho (TBT) foram utilizados como biocidas em tintas antivegetativas (AV) e amplamente aplicados, durante décadas, de forma a evitar a bioincrustação em superfícies submersas, principalmente em cascos de embarcações. Os seus efeitos deletérios em organismos não-alvo tornaram-se evidentes após o aparecimento de gastrópodes prosobrâquios com imposex – sobreposição de caracteres sexuais masculinos sobre o tracto reprodutivo das fêmeas. Desde então, a expressão do imposex em prosobrânquios tem sido amplamente utilizada como biomarcador da poluição por TBT. Um dos objectivos da presente tese é avaliar se as mais recentes restrições legais na utilização das tintas AV com compostos organoestânicos (OTs) resultaram numa redução da poluição pelos mesmos na costa continental Portuguesa. Para tal, foi levada a cabo a análise da variação temporal do imposex como biomarcador dos níveis ambientais de TBT e a validação de procedimentos, de modo a seguir de forma precisa a evolução da intensidade deste fenómeno ao longo do tempo. O trabalho de investigação teve início no momento em que a ineficácia da legislação anterior (Directiva 89/677/CEE) na redução da poluição por TBT no litoral Português era reportada na literatura e quando estavam já agendados instrumentos decisivos para a diminuição definitiva deste tipo de poluição: o Regulamento (CE) N.º 782/2003 do Parlamento e do Conselho da União Europeia (UE) que bania as tintas AV baseadas em TBT na sua frota a partir de 1 de Julho de 2003; a "Convenção Internacional sobre o Controlo de Sistemas Antivegetativos Nocivos em Navios” (Convenção AFS), adoptada em 2001 pela Organização Marítima Internacional (OMI), que procurava erradicar os OTs da frota mundial até 2008. Os níveis de imposex e as concentrações de OTs nos tecidos de fêmeas de Nucella lapillus foram medidos em 17 locais de amostragem ao longo da costa Portuguesa em 2003, a fim de se avaliarem os impactos do TBT nas populações desta espécie e de se criar uma base de dados para seguir a sua evolução futura. O índice da sequência do vaso deferente (VDSI), o índice do tamanho relativo do pénis (RPSI) e a percentagem de fêmeas afectadas por imposex (%I) foram utilizados na medição da intensidade deste fenómeno em cada local de amostragem e os seus valores variaram entre 0,20-4,04, 0,0- 42,2% e 16,7-100,0%, respectivamente. Foram encontradas fêmeas estéreis em 3 locais de amostragem, com percentagens a variar entre 4,0 e 6,2%. As concentrações de TBT e dibutilestanho (DBT) nas fêmeas variaram respectivamente entre 23-138 e <10-62 ng Sn.g-1 de peso seco, e o conteúdo em TBT nos tecidos revelou-se significativamente correlacionado com o imposex (nomeadamente com o RPSI e o VDSI). Os níveis de expressão do fenómeno e o conteúdo em OTs nos tecidos, foram superiores na proximidade de portos, confirmando as conclusões obtidas anteriormente por outros autores de que os navios e a actividade dos estaleiros são as principais fontes destes compostos no litoral Português. As infra-estruturas associadas ás principais fontes de OTs – portos, estaleiros e marinas – estão geralmente localizadas no interior de estuários, motivo pelo qual estas áreas têm vindo a ser descritas como as mais afectadas por estes poluentes. Por esta razão, foi levado a cabo o estudo pormenorizado da poluição por TBT na Ria de Aveiro, como caso de estudo representativo da poluição por estes compostos num sistema estuarino em Portugal continental. N. lapillus foi usada como bioindicador para avaliar a tendência temporal da poluição por TBT nesta área entre 1997 e 2007. Foi registada uma diminuição da intensidade do imposex após 2003, embora as melhorias mais evidentes tenham sido observadas entre 2005 e 2007, provavelmente devido à implementação do Regulamento (CE) N.º 782/2003 que proibiu a aplicação de tintas AV com TBT em navios com a bandeira da UE. Apesar desses progressos, as análises ao conteúdo em OTs nos tecidos de fêmeas de N. lapillus e em amostras de água colhidas em 2006 indicaram contaminação recente por TBT na área de estudo, evidenciando assim a permanência de fontes de poluição. A utilização de N. lapillus como bioindicador da poluição por TBT na Ria de Aveiro apresenta algumas limitações uma vez que a espécie não ocorre nas áreas mais interiores da Ria e não vive em contacto com sedimentos. Assim, a informação obtida a partir da sua utilização como bioindicador é fundamentalmente relativa aos níveis de TBT na coluna de água. Foi então necessário recorrer a um bioindicador complementar – Hydrobia ulvae – para melhor avaliar a evolução temporal da poluição por TBT no interior deste sistema estuarino e estudar a persistência de TBT nos sedimentos. Não foi registada uma diminuição dos níveis de imposex em H. ulvae na Ria de Aveiro entre 1998 e 2007, apesar da aplicação do Regulamento (CE) N.º 782/2003. Pelo contrário, houve um aumento global significativo da percentagem de fêmeas afectadas por imposex e um ligeiro aumento do VDSI, contrastando com o que tem sido descrito para outros bioindicadores na Ria de Aveiro no mesmo período. Estes resultados mostram que a diferente biologia/ecologia das espécies indicadoras determina vias distintas de acumulação de TBT, apontando a importância da escolha do bioindicador dependendo do compartimento a ser monitorizado (sedimento versus água). A ingestão de sedimento como hábito alimentar em H. ulvae foi discutida como sendo a razão para a escolha da espécie como indicadora da contaminação dos sedimentos por TBT. Foram também estudados os métodos mais fiáveis para reduzir a influência de variáveis críticas na medição dos níveis de imposex em H. ulvae. As comparações de parâmetros do imposex baseados em medições do pénis devem ser sempre realizadas sob condições de narcotização bem standardizadas uma vez que este procedimento provoca um aumento significativo do comprimento do pénis (PL) em ambos os sexos. O VDSI, a % e o PL em ambos os sexos revelaram ser fortemente influenciados pelo tamanho dos espécimes: a utilização de fêmeas mais pequenas conduz à subestimação do VDSI, da %I e do PL, enquanto que diferenças no tamanho dos machos provocam variações no índice do comprimento relativo do pénis (RPLI), independentemente dos níveis de poluição por TBT. Existe, portanto, a necessidade de controlar algumas variáveis envolvidas na análise do imposex que mostraram afectar a fiabilidade dos resultados. Uma vez que N. lapillus é o principal bioindicador dos efeitos biológicos específicos do TBT para a área da OSPAR, foi também estudada a influência de algumas variáveis na avaliação dos níveis de imposex nesta espécie, especificamente as relacionadas com o ciclo reprodutor e o tamanho dos espécimes. O estudo do ciclo reprodutor e a variação sazonal/espacial do comprimento do pénis do macho (MPL) incidiu num único local no litoral Português (Areão – região de Aveiro) de forma a avaliar se o RPSI varia sazonal e espacialmente na mesma estação de amostragem e se tais variações influenciam os resultados obtidos em programas de monitorização do imposex. Nos meses de Dezembro de 2005 a Junho de 2007, foram encontrados espécimes de N. lapillus sexualmente maturos e potencialmente aptos para a reprodução. Contudo, foi também evidente um padrão sazonal do ciclo reprodutor – o estado de desenvolvimento da gametogénese nas fêmeas variou sazonalmente e ocorreu uma diminuição do volume da glândula da cápsula e do factor de condição no final do Verão / início do Outono. Contrariamente, a gametogénese nos machos não apresentou variação sazonal significativa, embora os valores mais baixos do factor de condição, do comprimento do pénis e dos volumes de esperma e da próstata tenham também sido registados no final do Verão / início do Outono. Além disso, o MPL mostrou variar, no mesmo local de amostragem, inversamente com a distância aos ninhos de cápsulas ovígeras; um aumento dos valores do MPL foi também observado em espécimes de maior tamanho. Todas estas variações no MPL introduzem desvios nos resultados da avaliação do imposex quando é usado o RPSI. A magnitude do erro envolvido foi quantificada e revelou-se superior em locais com níveis mais elevados de poluição por TBT. Apesar do RPSI ser um índice que fornece informação importante sobre os níveis de poluição por TBT, a sua interpretação deve ser cuidadosa e realizada complementarmente com os outros índices, destacando-se o VDSI como índice mais fiável e com significado biológico mais expressivo. Novas campanhas de monitorização do imposex em N. lapillus foram realizadas ao longo da costa Portuguesa em 2006 e 2008, e os resultados subsequentemente comparados com a base de dados criada em 2003,de forma a avaliar a evolução da poluição por TBT no litoral Português naquele período. Nestes estudos foram aplicados novos procedimentos na monitorização e tratamento dos dados, de forma a minimizar a variação nos índices de avaliação do imposex induzida pelos factores acima descritos, para seguir com maior consistência a tendência da poluição por TBT entre 2003 e 2008. Foi observado um declínio global significativo na intensidade de imposex na área de estudo durante o referido período e a qualidade ecológica da costa Portuguesa, segundo os termos definidos pela Comissão OSPAR, revelou melhorias notáveis após 2003 confirmando a eficácia do Regulamento (CE) N.º 782/2003. Não obstante, as populações de N. lapillus revelaram-se ainda amplamente afectadas por imposex, tendo sido detectadas emissões de TBT na água do mar ao longo da costa em 2006, apesar da restrição anteriormente referida. Estes inputs foram atribuídos principalmente aos navios que à data ainda circulavam com tintas AV com TBT aplicadas antes de 2003, uma vez que a sua utilização nas embarcações foi apenas proibida em 2008. Considerando que o Regulamento (CE) N.º 782/2003 constitui uma antecipação da proibição global da OMI que entrou em vigor em Setembro de 2008, prevê-se, por analogia, que haja uma rápida diminuição da poluição por TBT à escala mundial num futuro próximo. Na sequência desta previsão, é apresentada uma discussão teórica preliminar relativamente ás possíveis estratégias usadas por N. lapillus na recolonização de locais onde, no passado, as populações terão aparentemente sido extintas devido a níveis extremamente elevados de TBT. Estes locais são tipicamente zonas abrigadas junto de infra-estruturas portuárias, cuja recolonização por esta espécie será provavelmente muito lenta dada a mobilidade reduzida dos adultos e o ciclo de vida não apresentar fase larvar pelágica. Foram então equacionadas duas hipotéticas vias de recolonização de zonas abrigadas por espécimes provenientes de populações de costa aberta/exposta: a migração de adultos e/ou a dispersão de juvenis. No entanto, em ambos os casos, estaria implicada a transposição de um problema amplamente descrito na bibliografia: as populações de N. lapillus de costa aberta podem apresentar um fenótipo muito diferente das de zonas abrigadas, podendo inclusivamente variar no número de cromossomas. A recolonização pode portanto não ter sucesso pelo simples facto dos novos recrutas não estarem bem adaptados aos locais a recolonizar. Para analisar este problema, foram estudados tanto a forma da concha de espécimes de N. lapillus ao longo da costa Portuguesa como o respectivo número de cromossomas. Embora a forma da concha tenha revelado diferenças, de acordo com o grau de hidrodinamismo entre as populações de N. lapillus avaliadas, o cariótipo 2n = 26, típico de zonas expostas, foi registado em todos os locais amostrados. Por outro lado, foi também testada em laboratório a possível mortalidade de juvenis em dispersão no interior menos salino dos estuários. Foi então verificada a ocorrência de mortalidade elevada de juvenis expostos a salinidades baixas (=100% após 1 hora a salinidades ≤9 psu), o que também pode comprometer a recolonização de zonas estuarinas menos salinas por esta via. Mesmo assim, os juvenis mostraram um comportamento de flutuação à superfície da água em condições laboratoriais, que pode ser considerado um benefício específico na colonização de áreas mais internas dos estuários, se tal facto vier a ser confirmado em estudos de campo. As conclusões deste estudo contribuem certamente para a descrição do final da “história do TBT” dado que, uma vez controlados alguns factores determinantes no uso do imposex como biomarcador, a avaliação do declínio da poluição por estes compostos, agora esperado à escala global, se torna mais rigorosa.

Tributyltin (TBT) compounds were used as biocides in antifouling (AF) paints and largely applied, during decades, to prevent bioincrustation in submerged surfaces, mainly on vessels hulls. TBT deleterious effects on nontarget organisms had only became apparent with the upsurge of prosobranch gastropods exhibiting imposex – the superimposition of male sexual characters onto females’ reproductive tract. Since then, imposex expression in prosobranchs has been largely used as a biomarker of TBT pollution. One of the objectives of this thesis is to evaluate if the most recent legal restrictions on the use of organotins (OTs) based AF paints resulted in a reduction on the pollution by these compounds in the Portuguese mainland coast. With this purpose, the analysis of imposex temporal trend was made, as a biomarker of the TBT environmental levels, as well as the procedures validation aiming to achieve a precise way to track the evolution of this phenomenon intensity over time. The research work began at the moment when descriptions on the inefficacy of previous measures (Directive 89/677/ECC) in reducing TBT pollution in the Portuguese littoral were reported in the literature and when the most decisive instruments to diminish this kind of pollution were already scheduled: the European Union (EU) Council Regulation (EC) No.782/2003 banning TBT-based AF paints in their fleet from 1 July 2003; the “International Convention on the Control of Harmful Antifouling Systems on Ships” (AFS Convention), adopted in 2001 by the International Maritime Organization (IMO), seeking OTs eradication from the global fleet by 2008. Nucella lapillus imposex levels and OTs females body burden (b.b.) were surveyed on the Portuguese open coast at 17 sampling sites in 2003 in order to assess the existing TBT impacts in this species populations’ and to create a baseline for tracking its future evolution. The vas deferens sequence index (VDSI), the relative penis size index (RPSI) and the percentage of females affected with imposex (%I) were used to assess this phenomenon intensity at each site and were 0.20-4.04, 0.0-42.2% and 16.7-100.0%, respectively. Sterile females were found at 3 sites, with percentages varying between 4.0 and 6.2%. TBT and dibutyltin (DBT) females b.b. were 23-138 and <10-62 ng Sn.g-1 dry weight, respectively, and TBT was significantly correlated with imposex (namely with RPSI and VDSI). Imposex levels and OTs in tissues were highest at sites located in the proximity of harbours, confirming ships and dockyard activities as their main sources in the Portuguese coast. The infrastructures associated with OTs major sources – ports, dockyards and marinas – are usually located within estuaries, reason why these have been described as the most affected areas by these pollutants. Hence, a detailed study on the TBT pollution in Ria de Aveiro was performed, as a case study representing the pollution caused by these compounds in an estuarine system in Portugal. N. lapillus was used as bioindicator to evaluate the TBT pollution temporal trend in this area between 1997 and 2007. A decrease in imposex intensity has been registered after 2003. Nevertheless, the most evident improvements were observed between 2005 and 2007, probably due to the implementation of Regulation (EC) No.782/2003 prohibiting AF paints application in vessels carrying EU flags. Despite these progresses, OTs analyses in females’ tissues and in water samples carried out in 2006 indicated TBT fresh inputs in the study area, thus evidencing the pollution sources persistency. The use of N. lapillus as bioindicator of TBT pollution in Ria de Aveiro presents some limitations since the species is not present in the Ria innermost areas and does not live in contact with sediments. Therefore, the information obtained from its use as a bioindicator is mostly relative to TBT levels in the water column. It was then necessary to use a complementary bioindicator – Hydrobia ulvae – to better evaluate the temporal evolution of TBT pollution within this estuarine system and study the persistency of TBT in sediment. No decrease in H. ulvae imposex levels was registered in Ria de Aveiro between 1998 and 2007, despite the application of the Regulation (EC) No.782/2003. On the contrary, there was a global significant increase in the percentage of imposex affected females and a slight VDSI raise, contrasting with what has been described for other bioindicators in Ria de Aveiro in the same period. These results show that different biology/ecology traits determine distinct routes of TBT uptake and/or bioaccumulation, pointing the importance of choosing the bioindicator depending on the compartment being monitored (sediment vs. water). Sediment ingestion as feeding habit was discussed as the reason for choosing H. ulvae as a bioindicator of TBT pollution persistence in sediments. The most reliable methods to reduce the influence of critical variables on H. ulvae imposex levels to assess TBT pollution were also studied. Comparisons of imposex parameters based on penis measurements should always be performed under well standardized narcotization conditions as the procedure causes a significant increase in both genders’ penis length (PL). VDSI, %I and both genders’ PL were strongly influenced by specimens’ size: smaller females induce VDSI, %I and females’ PL (FPL) underestimation, whilst variation in males’ size causes oscillations in the relative penis length index (RPLI), regardless of TBT pollution levels. These results prompted the need to control some variables involved in imposex analysis that were proved to affect its results reliability. As Nucella lapillus is the main bioindicator of TBT-specific biological effects within the OSPAR area, the influence of those critical variables in this species imposex levels assessment were also studied, specifically those related with the reproductive cycle and specimens’ size. The reproductive cycle and the male penis length (MPL) seasonal / spatial variation were studied at a single site in the Portuguese littoral (Areão – Aveiro region) to assess if RPSI varies seasonally and spatially in the same sampling site and if this can affect results obtained in imposex monitoring programmes. N. lapillus specimens potentially able to reproduce were found every month from December 2005 to June 2007. However, a seasonal pattern in the reproductive cycle was also evident – females’ gametogenic maturation varied seasonally and a decrease in capsule gland volumes and condition factor occurred in late summer / early autumn. On the other hand, gametogenesis in males did not show a significant seasonal variation as in females but the condition factor, penis length, amount of sperm and prostate volume also diminished in late summer / early autumn. Besides, MPL has also showed to vary inversely with distance to egg capsules clusters at the same shore; increased MPL values in bigger specimens’ were also observed. All these MPL variations introduce a bias on imposex assessment results when using RPSI. The magnitude of the error involved was also quantified and is greater at places with higher TBT pollution levels. Despite being an index that provides important information about TBT pollution levels, RPSI interpretation must be careful and accomplished complementarily with other indices, with the VDSI being the most reliable and biologically meaningful. New monitoring campaigns of N. lapillus imposex were made along Portuguese coast in 2006 and 2008 and the results subsequently compared with the baseline created in 2003, in order to evaluate TBT pollution evolution in the Portuguese littoral in that period. New monitoring and data analysis procedures were applied in these studies, in order to minimize the variation in imposex assessment indices induced by the above described factors, for a consistent evaluation of the TBT pollution trend in the Portuguese coast from 2003 to 2008. A significant global decline in imposex intensity was observed in the study area during the referred period and the Portuguese coast ecological status, under the terms defined by the OSPAR Commission, has notably improved after 2003 confirming the effectiveness of the Regulation (EC) No.782/2003. Nevertheless, N. lapillus populations are still extensively affected by imposex and fresh TBT inputs were detected in seawater throughout the coast in 2006. These recent inputs are attributed to vessels still carrying TBT antifoulants applied before 2003, as their presence in vessels was only forbidden in 2008. Considering that Regulation (EC) No.782/2003 is an anticipation of the IMO global ban entered into force in September 2008, it is predicted, by analogy, that a rapid decrease of TBT pollution will take place on a global scale in a near future. Following this prediction, a preliminary theoretical discussion is presented on N. lapillus possible strategies to recolonize sites where, in the past,populations were apparently extinct by extremely high TBT pollution levels. These places are typically sheltered areas near ports infrastructures, which recolonization by this species will probably be very slow since adults have reduced mobility and the life cycle has no pelagic phase. Thus, two hypothetical ways for the recolonization of sheltered areas by specimens from the open/exposed shore were equated: the adults’ migration and/or the juveniles’ dispersion. However, in both cases, the transposition of a problem widely described in the literature would be implied: N. lapillus open shore populations may present a phenotype much different than those at sheltered areas, a difference that may inclusively involve chromosomes number variation. Recolonization can be therefore unsuccessful because of the simple fact that the new recruits may not be well adapted to the site to be recolonized. To this problem analysis, N. lapillus shell shape was studied along Portuguese coast as well as the respective specimens’ chromosomes number. Although shell shape has revealed differences regarding the hydrodynamics degree between the evaluated populations, the karyotype 2n=26, typical from exposed shores, was registered at all sampled sites. On the other hand, the possible mortality of juveniles in dispersion on the less saline inner estuary was also tested in laboratory. Then, it was verified the occurrence of high juvenile mortality exposed to lower salinity (=100% after one hour under salinity ≤9 psu), what can also compromise recolonization of less saline estuarine areas. Even though, juveniles showed a floating behaviour on the water surface under laboratory conditions, which can be considered as a specific asset regarding colonization of inner estuarine parts, if confirmed with data collected from field studies. This study conclusions certainly contribute for the “TBT tale” final description, once the control of some factors responsible for the use of imposex as a biomarker allows a more thorough evaluation of these compounds pollution, now expected at the global scale.
description: Doutoramento em Biologia
URI: http://hdl.handle.net/10773/971
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