Structural characterization of proteins associated to autophagy

Abstract

DOR (ou Tumor protein p53 inducible nuclear protein 2 - tp53inp2) é uma proteína bifuncional que atua no núcleo e no citosol. No núcleo DOR atua como um co-fator nuclear, liga-se e co-ativa no recetor da hormona da tiróide. No último, DOR desloca-se do núcleo para o citoplasma em situações de ativação da autofagia ou stress celular, localiza-se no autofagossoma e interage diretamente com as proteínas associadas à membrana do autofagossoma, LC3 e GATE16. A caraterização da interação entre a DOR e os seus parceiros e a relevância da DOR na autofagia é muito importante. A autofagia tem um papel importante no envelhecimento, morte celular, defesa contra agentes intracelulares patogénicos, doenças neurodegenerativas e tumorogenesis, o que demonstra a importância biológica e médica de estudar as proteínas envolvidas neste processo. A proteína de fusão NusA-DOR e os seus interatores, LC3 e GATE16, foram expressos em E.coli. Todas as proteínas foram purificadas por cromatografia de afinindade, seguida por cromatografia de exclusão molecular (DOR) ou por cromatografia de troca iónica (LC3 e GATE16). A estabilidade da DOR e a interação com os seus parceiros intracelulares foi analisada estruturalmente, através de ressonância plasmónica de superfície, circular dicroísmo e estabilidade térmica. Um péptido da DOR contendo o local de interação (região LIR) foi produzido para os ensaios de co-cristalização por difusão vapor. O péptido da DOR liga num sulco da LC3 numa conformação em gancho, dois importantes aminoácidos medeiam a interação com LC3, Trp35 e a Leu38. A conformação desta estrutura é diferente das outas estruturas conhecidas da LC3 com domínios LIR.

DOR (or Tumor protein p53 inducible nuclear protein 2 - tp53inp2) is a bifunctional protein that operates both in the nucleus and in the cytosol. In the nucleus, DOR acts as a nuclear co-factor, and binds to and co-activates the thyroid hormone receptor. In the later, DOR moves from the nucleus to the cytoplasm under conditions characterized by the activation of autophagy or cellular stress and can be localized to early autophagosome and interact directly with the autophagosome membrane associated protein LC3 and GATE16. Characterization of the interaction between DOR and its interacting partners is very important to understand the relevance of DOR in autophagy. Since autophagy plays a protective role in aging, cell death, defense against intracellular pathogens, neurodegenerative diseases and tumorogenesis, studying DOR might have a large biological and medical relevance. The fusion protein NusA-DOR and its interactors, LC3 and GATE16, were expressed in E.coli. All the proteins were purified by affinity chromatography, followed by size exclusion chromatography (DOR) or ion exchange chromatography, (LC3 and GATE16). The stability of DOR and the interaction with intracellular partners has been structurally analyzed, by surface plasmon resonance, circular dichroism and differential scanning fluorimetry. A DOR peptide containing the interaction site (LIR motif) has been produced for cocrystallization experimentss. The DOR peptide binds within LC3 groove in a hairpin conformation, two important amino acids, Trp35 and Leu38 mediated the insertion into pockets of LC3. This peptide displays a new conformation, when compared with the known three-dimensional strutures of LC3:LIR complexes.