Molecular biomarkers in fish exposed to xenobiotics

Abstract

Os organismos aquáticos estão expostos a uma grande variedade de contaminantes. Biomarcadores medidos ao nível molecular têm sido propostos como ferramentas sensíveis para a detecção precoce de efeitos biológicos da contaminação, permitindo a aplicação de estratégias de bioremediação antes do aparecimento de danos irreversíveis e com consequências ecológicas. Foram analisadas em três espécies de peixes (Anguilla anguilla, Dicentrarchus labrax e Liza aurata) diferentes respostas moleculares associadas à exposição a diferentes contaminantes com o objectivo de desenvolver novos biomarcadores. Espécimes imaturos juvenis de A. anguilla foram expostos em laboratório a dois potentes hidrocarbonetos policíclicos aromáticos, benzo[a]pireno e 7,12-dimetilbenz[a]antraceno (DMBA). Uma análise dos resultados mostrou que células do fígado, brânquias e sangue de A. anguilla expostas a estes compostos sofreram um aumento nos níveis de danos no DNA, medidos por “comet assay”, embora não tenham sido detectados, por citometria de fluxo, danos cromossomais. Alterações genéticas específicas, incluído mutações no gene ras e alterações na expressão dos genes ras e rad1, foram também analisadas não tendo sido encontradas diferenças. Em resposta à exposição a DMBA foram também detectadas alterações nos níveis de expressão de genes envolvidos no metabolismo de xenobióticos, resposta imunes e dinâmica do citosqueleto. Esta abordagem realçou a complexidade da resposta observada em peixes expostos a compostos genotóxicos e constituiu a base para o desenvolvimento de novos biomarcadores. Com o intuito de estudar um cenário mais realista, espécimes de D. labrax e L. aurata foram capturados em diferentes locais contaminados da Ria de Aveiro (Portugal). Biomarcadores usualmente aplicados como, por exemplo, as lesões histopatológicas do fígado e a avaliação da integridade do DNA revelaram o impacto da exposição nas espécies analisadas. Outras respostas moleculares foram também avaliadas e revelaram a ausência de mutações no gene ras, enquanto que a expressão do gene xpf, envolvido na reparação de DNA, se mostrou diminuída em peixes capturados em locais contaminados. Nestes animais, genes envolvidos na produção de energia, resposta imune e defesa contra o stress oxidativo tiveram também a sua expressão alterada. A expressão destes genes, que estão implicados numa variedade de processos celulares, pode actuar como um indicador precoce de exposição ou de efeito da contaminação em peixes. Estes novos potenciais biomarcadores poderão futuramente ser ancorados a biomarcadores tradicionais em programas de biomonitorização ambiental, contribuindo para uma detecção precoce da exposição a contaminantes e, consequentemente, para a prevenção dos efeitos observados a níveis superiores da organização biológica. Para além da sua potencial aplicação como biomarcadores, as respostas moleculares estudadas no presente trabalho, contribuíram também para uma melhor compreensão da resposta dos peixes à toxicidade.

Aquatic organisms are exposed to a wide variety of contaminants introduced into the environment as a consequence of anthropogenic activities. Biomarkers measured at the molecular level have been proposed as sensitive ‘early warning’ tools for biological effect measurement in environment quality assessment, allowing the initiation of bioremediation strategies before irreversible environmental damage of high ecological impact occur. Different exposure-related molecular responses were analysed in three fish species (Anguilla anguilla, Dicentrarchus labrax and Liza aurata), with the broad aim of developing novel biomarkers. Juvenile specimens of A. anguilla were exposed under well-defined laboratory conditions to two potent polycyclic aromatic hydrocarbons (PAH), benzo[a]pyrene and 7,12-dimethylbenz[a]anthracene (DMBA). Liver, gill and blood cells of A. anguilla exposed to PAHs showed increased levels of DNA damage as measured by comet assay, although no permanent chromosomal damage was detected in any of those tissues by flow cytometry. Specific gene alterations, including mutations in ras gene and altered expression of ras and rad1 genes, were also analysed however no differences could be detected. Genes involved in xenobiotic metabolism, immune processes and cytoskeleton dynamics were found to be differently expressed in response to DMBA, as revealed by suppression subtractive hybridization (SSH). This approach highlighted the complexity of the response observed in fish exposed to genotoxic compounds and constituted the basis for new biomarker development. To study a more realistic scenario, specimens of D. labrax and L. aurata were captured at different contaminated sites in Ria de Aveiro (Portugal) lagoon. Well-established biomarker responses such as liver histopathological lesions and detection of DNA damage revealed the impact of exposure in the species analysed. The molecular responses further studied revealed no alterations in the ras gene, while the expression of the DNA repair-related xpf gene was found decreased in exposed fish. An altered expression was also found in genes related to energy production, immune response and oxidative stress defence, using the SSH methodology. The expression of these genes, which span a broad range of cellular processes, has the potential to act as early signal of exposure to or effect of contamination in fish. These potential novel molecular biomarker responses could then be anchored to traditional biomarkers in environmental monitoring programs, contributing to an earlier detection of contamination exposure and, consequently, to the prevention of some of the effects observed at higher levels of biological organization. In addition to their potential biomarker application, the molecular responses studied in the present work, have also contributed to a better understanding of the integrated toxic response in fish.