C. albicans Cek1 and Ras1: cloning, expression and purification

Abstract

Candida albicans é um fungo polimórfico e patogénico que reside de forma comensal nas superfícies mucosas humanas. Este fungo apresenta um código genético ambíguo, uma vez que, o codão universal leucina CUG é predominantemente traduzido como serina (97%), mas também como leucina (3%). A análise de proteínas de C. albicans que contêm resíduos CUG em importantes posições funcionais, revela que a ambiguidade do codão modela a função da proteína e poderá ter um papel determinante nas vias de sinalização associadas a mudanças morfológicas e patogénicas. Com o presente estudo pretende-se investigar o efeito da leucina e da serina nas posições CUG (ambiguidade CUG) na estrutura e função de duas proteínas chave nas vias de sinalização de C. albicans, a Ras1 (GTPase) e a Cek1 (Cinase). Estas regulam a transcrição dos genes associados com mudanças morfológicas, patológicas e, por outro lado, contêm resíduos CUG numa posição estritamente conservada e com relevo funcional. Neste contexto foi possível clonar com sucesso genes sintéticos para os centros ativos da Ras1 e Cek1 (variantes de serina e de leucina para o codão CUG) em vetores que apresentam diferentes caudas de solubilidade (MBP, NusA, Trx, ZTag2 e Gb1). Foram desenvolvidos protocolos de alta expressão bacteriana e de purificação para os domínios ativos Ras1 (ligado à Gb1) e Cek1 (ligado à MBP). A análise dos resultados de purificação analítica e de “Dynamic Light Scaterring” demonstraram que as proteínas recombinantes se apresentam na forma monomérica. Ensaios de cristalização estão a ser realizados esperando-se determinar as estruturas tridimensionais das proteínas por cristalografia de raio-X. As estruturas da Cek1 e Ras1 com leucina e serina nas posições CUG, conjuntamente com uma análise meticulosa da sua estabilidade e função in vitro, irão fornecer informações importantes sobre o papel estratégico da ambiguidade natural do codão.

The polymorphic fungal pathogen Candida albicans has an ambiguous genetic code, as the universal leucine CUG codon is predominantly translated as serine (97%) but also as leucine (3%). Analysis of the rare C. albicans proteins containing CUG-encoded residues in functionally relevant positions reveals that codon ambiguity shapes protein function and might have a pivotal role in signaling cascades associated with morphological changes and pathogenesis. The present study investigates the effect of leucine or serine at CUG positions (CUG ambiguity) in the structure and function of two key effectors of signaling cascades in C. albicans, Ras1 (GTPase) and Cek1 (protein kinase), which regulate the transcription of genes associated with morphological changes and pathogenesis. These two proteins contain a CUG residue in a strictly conserved and functionally relevant position. Synthetic genes coding for the active domains of Ras1 and Cek1 (serine and leucine variants for the CUG codon) were successfully cloned into expression vectors carrying different solubility partners (MBP, NusA, Trx, ZTag2 and Gb1). Furthermore, using an incomplete factorial approach, high level bacterial expression and purification protocols for the active domains of Ras1 (in fusion with Gb1) and Cek1 (in fusion with MBP) were developed. Analytical size exclusion chromatography (SEC) and dynamic light scattering (DLS) results indicate that both recombinant proteins are monomeric. Crystallization trials must be done aiming for the determination of their threedimensional structures by X-ray crystallography. The structures of Ras1 and Cek1 with serine or leucine at CUG positions, together with a thorough analysis of their stability and function in vitro, will provide valuable insights into a possible strategic role of natural codon ambiguity.