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 Aplicação da citometria de fluxo ao estudo do genoma vegetal
Please use this identifier to cite or link to this item http://hdl.handle.net/10773/931

title: Aplicação da citometria de fluxo ao estudo do genoma vegetal
authors: Loureiro, João Carlos Mano
advisors: Santos, Conceição
Dolezel, Jaroslav
keywords: Biologia
Citometria de fluxo
Genomas
Citologia
issue date: 2007
publisher: Universidade de Aveiro
abstract: Hoje em dia, a aplicação da citometria de fluxo (CMF) no estudo do genoma vegetal consiste maioritariamente em análises do nível de ploidia e em estimativas do conteúdo em ADN nuclear. Esta Tese de Doutoramento tem como objectivo aplicar a CMF e outras técnicas citológicas, como a microscopia de fluorescência e a hibridização in situ, no estudo do genoma vegetal. O primeiro Capítulo introduz a CMF, nomeadamente o seu funcionamento, aspectos metodológicos da análise do conteúdo em ADN nuclear em plantas, e aplicações da CMF na biologia vegetal. No Capítulo II são apresentados dois estudos sobre a estabilidade do nível de ploidia durante o processo de cultura in vitro de sobreiro (Capítulo II.1) e zimbro (Capítulo II.2), duas espécies lenhosas de elevada importância económica e ecológica. No Capítulo III são apresentados os resultados das análises de conteúdo em ADN nuclear efectuadas em três grupos de espécies vegetais. No Capítulo III.1 a CMF foi utilizada para estimar pela primeira vez o tamanho do genoma nuclear de cultivares de oliveira e zambujeiro; a variação intraspecífica como tópico de elevado interesse é aqui discutida tendo em consideração as boas práticas. No Capítulo III.2 foi analisado o conteúdo em ADN nuclear de três espécies de Ulmaceae da Península Ibérica que contêm compostos mucilaginosos, conhecidos por interferirem com as análises por CMF; é também apresentado um protocolo eficiente que previne o efeito negativo deste compostos e permite uma correcta análise do tamanho do genoma de espécies com problemas similares. No Capítulo III.3 é apresentado um estudo extensivo de CMF e citogenética molecular realizado em espécies de festuca da Península Ibérica. Considerando os resultados obtidos nos Capítulos II e III, no Capítulo IV foram efectuados estudos inovadores de índole metodológica. No Capítulo IV.1 é apresentada a primeira comparação sistemática de tampões de isolamento nuclear, enquanto no Capítulo IV.2 é estudado o efeito negativo do ácido tânico, um composto fenólico conhecido por interferir com os núcleos vegetais e com as estimativas de conteúdo em ADN. De acordo com os resultados obtidos nestes estudos, no Capítulo IV.3 foram testados dois novos tampões de lise nuclear em 37 espécies vegetais. No Capítulo V é introduzida a base de dados “Plant DNA Flow Cytometry (FLOWER)”. Esta base de dados contém informações retiradas de mais de 700 publicações na área da CMF vegetal, disponibilizando-as de uma forma atraente e permitindo a realização de análises quantitativas respeitantes a muitos tópicos importantes. Finalmente, no Capítulo VI são apresentadas as conclusões da presente Tese de Doutoramento, com especial incidência nas boas práticas necessárias para estimar o conteúdo em ADN nuclear em plantas e nas direcções futuras da CMF no estudo do genoma vegetal. ABSTRACT: Nowadays, the application of flow cytometry (FCM) to study plant genomes is mostly focused on DNA ploidy level analyses and nuclear DNA content estimations. The objective of this PhD Thesis is to applly FCM and related techniques, as fluorescence microscopy and in situ hybridization, to study plant genomes. The first chapter introduces FCM, namely the functioning of this technique, the methodological aspects of the analysis of nuclear DNA content in plants, and the applications of FCM in plant sciences. In Chapter II, studies of ploidy stability of the in vitro culture process of two economically important woody plant species, Quercus suber (Chapter II.1) and Juniperus phoenicea (Chapter II.2), are presented. In Chapter III, three studies regarding nuclear DNA content analyses in plant species are given. In Chapter III.1 the genome size of olive cultivars and wild olive was estimated for the first time using FCM; the hot topic of intraspecific variation is discussed here with respect to best practices. In Chapter III.2, the nuclear DNA content of three Ulmaceae species, containing mucilaginous compounds that interfere with FCM analysis, is analysed; an efficient protocol that circumvented this problem and enabled reliable genome size estimations in these species is presented. A through flow cytometric and molecular cytogenetic study on fescue species of the Iberian Peninsula is performed in Chapter III.3. In light with the results obtained in Chapters II and III, innovative methodological studies were performed in Chapter IV. In Chapter IV.1 the first systematic comparison of lysis buffers is presented, while in Chapter IV.2 the negative effect of tannic acid, a common phenolic compound known to interfere with plant nuclei and DNA content estimations, is analysed. According with the results obtained in these studies, in Chapter IV.3 two new lysis buffers were tested with a set of 37 plant species. In chapter V the Plant DNA Flow Cytometry Database (FLOWER) is introduced. The FLOWER database collects information from more than 700 publications in this area of FCM, and makes it accessible in one user-friendly design that enables quantitative analysis of many important topics. Finally in Chapter VI the conclusions of the present PhD Thesis are presented with special focus on a compilation of best practices for nuclear DNA estimation using FCM and the future directions on the use of this technique to study plant genomes.
description: Doutoramento em Biologia
URI: http://hdl.handle.net/10773/931
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UA - Teses de doutoramento

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