I-2L, a novel putative PP1 inhibitor in human sperm

Abstract

A proteína fosfatase-1 (PP1) é uma proteína fosfatase ubíqua e específica para a desfosforilação de resíduos de serina e treonina, que participa na regulação de diversos processos celulares. Em mamíferos, a actividade da PP1 está relacionada com a motilidade dos espermatozóides durante o percurso no tracto epididimal. Esta holoenzima é composta por uma subunidade catalítica, denominada PP1c, e por proteínas que interagem com a PP1 (PIPs) e a dirigem para a proximidade de substratos, determinando a sua actividade. A PP1 é codificada por três genes distintos: PP1α, PP1β e PP1γ. As isoformas PP1γ1 e PP1γ2 são originadas por splicing alternativo do gene PP1γ. PP1γ1 é uma isoforma ubíqua e a PP1γ2 é expressa maioritariamente no testículo e espermatozóides. O inhibidor-2 (I-2) de mamífero é uma PIP ancestral que se liga à PP1c, resultando na inibição da actividade da PP1. A reactivação deste complexo é desencadeada pela desfosforilação do I-2 no resíduo de Thr73 pela GSK-3. Atendendo às diversas funções que têm sido atribuídas à PP1, com base nas suas subunidades reguladoras, é crucial identificar novas PIPs. Assim, com o objectivo de identificar novas PIPs em testículo humano, procedeu-se ao rastreio de uma biblioteca de cDNA de testículo humano pelo método de dois híbrido de levedura, usando a PP1γ1 e PP1γ2 como isco. Foi assim obtido um clone muito semelhante ao I-2, denominado I-2L. Após um estudo comparativo por análise bioinformática, a principal diferença detectada foi a substituição de um resíduo de Thr73 por um de Pro73, no I-2L, conduzindo à ausência do local de fosforilação pela GSK-3, o que resulta num novo mecanismo de regulação para o complexo PP1γ2-I-2L. A presença de I-2/I-2L em espermatozóides humanos foi confirmada pelos métodos de Western blot e imunocitoquímica. As proteínas I-2/I-2L e a PP1γ2 co-localizam na peça intermédia e principal do flagelo dos espermatozóides, em concordância com o papel do complexo PP1γ2-(I-2/I-2L) na motilidade dos espermatozóides. A semelhança entre o I-2 e I-2L, em termos da sequência de aminoácidos (95%), origina um novo desafio na diferenciação destas duas proteínas. Consequentemente, foi analisado o fingerprint proteolítico do I-2 e I-2L para posterior análise por espectrometria de massa, sendo esta uma abordagem eficaz para provar a existência do I-2L in vivo. Estudos estão presentemente a decorrer no sentido de validar, por espectrometria de massa, a sequência de aminoácidos do I-2L imunoprecipitado de espermatozóides humanos.

Protein phosphatase-1 (PP1) is a ubiquitously expressed serine/threonine protein phosphatase that controls several cellular processes. In mammalian sperm, changes in PP1 activity correlates with sperm motility development during the transit through the epididymis. The PP1 holoenzyme structure is composed of a conserved subunit termed PP1c and PP1-interacting proteins (PIPs) which direct the holoenzyme to the proximity of its substrates, determining their activity. The catalytic subunit of PP1 is encoded by three different genes termed PP1α, PP1β and PP1γ. PP1γ1 and PP1γ2 are alternatively spliced isoforms of the PP1γ gene. PP1γ1 is ubiquitously expressed whereas PP1γ2 is mainly expressed is testis and sperm. Mammalian inhibitor-2 (I-2) is an ancient PIP that binds to PP1c, resulting in the inhibition of PP1 activity. The reactivation of this complex is triggered by phosphorylation of I-2 at Thr73 residue by GSK-3. Given all the roles that have been proposed to PP1 based on its binding subunits it seemed very important to identify novel PIPs. Thus, in order to search for novel PP1 regulator in human testis yeast two-hybrid screens were performed using PP1γ1 and PP1γ2 as baits to screen a human testis cDNA library. A clone was obtained very similar to I-2, termed I-2 Like (I-2L). After bioinformatics analysis comparison, the main difference detected was Thr73/Pro73 substitution which abolishes the GSK-3 phosphorylation site. This introduces a new regulatory mechanism for the PP1γ2-I-2L complex. The presence of I-2/I-2L in human sperm was confirmed by immunoblot and immunocytochemistry analysis. I-2/I-2L and PP1γ2 co-localize endogenously in the middle- and principal- piece of spermatozoa flagellum consistent with the role of PP1γ2-(I-2/I-2L) complex in sperm motility. The similarities between I-2/I-2L in terms of amino acid sequences (95%) introduced a challenge to differentiate I-2 and I-2L proteins. Hence, the proteolytic fingerprint of I-2 and I-2L was analyzed for further mass spectrometry (MS) analysis, and concluded that this was a fine approach to prove the existence of I-2L in vivo. Studies are now in progress in order to validate, via MS analysis, the amino acid sequence of I-2L immunoprecipitated from human sperm.