FK506-binding proteins : identification and analysis in Neurospora crassa

Abstract

Imunofilinas são receptores intracelulares de drogas imunossupressoras, como a ciclosporina A, FK506 e rapamicina, caracterizados por apresentarem actividade de peptidil-prolil cis-trans isomerase. Além do seu envolvimento no enovelamento de proteínas, novos estudos demonstram o envolvimento destas proteínas em processos celulares específicos como transdução de sinal, transporte e montagem de complexos proteícos e silenciamento de rDNA. Neste estudo propusemo-nos caracterizar as funções celulares das imunofilinas do tipo FKBP (FK506-binding proteins) identificadas em Neurospora crassa. Na procura pelo papel fisiológico destas proteínas confirmamos a localização celular das proteínas FKBP12, FKBP22 e FKBP50 e determinamos a localização subcelular da proteína FKBP11. Foi também analisada a expressão destas proteínas em resposta a diversos indutores de stress, realizadas imunoprecipitações e produzidos e analisados mutantes simples e duplos para os genes fkbp. Através da proteína de fusão FKBP50::GFP e extractos proteicos da estirpe selvagem foi possível confirmar a localização nuclear da FKBP50, a localização endoplasmática da FKBP22 e a localização mitocondrial e citoplasmática da FKBP13. Foi também possível determinar que a FKBP11 está localizada no citoplasma. Uma análise bioquímica mais detalhada destas proteínas demonstrou que a FKBP11 não é expressa durante o desenvolvimento vegetativo do fungo mas a sua expressão é induzida por elevados níveis de cálcio e durante o desenvolvimento sexual. Através de imunoprecipitações usando um soro contra a FKBP13 foi possível co-imunoprecipitar uma proteína de aproximadamente 40 kDa. O tratamento de extractos proteícos mitocondriais e citoplasmáticos com diferentes proteases demonstrou que a FKBP13 é extremamente resistente à proteólise por proteinase K e tripsina. A análise da expressão destas proteínas em resposta a diferentes indutores de stress sugere que a FKBP50 é regulada negativamente pelo cálcio. Os níveis de FKBP22 encontram-se mais elevados em resposta ao stress osmótico e oxidativo e os níveis de FKBP13 encontramse também aumentados na presença de elevados níveis de FKBP11, sugerindo uma possível ligação entre FKBP13 e FKBP11. Embora a disrupção dos genes fkbp11, fkbp13 e fkbp22 não conduza a num fenótipo detectável, a disrupção do gene fkbp50 resulta num fenótipo termo-sensível. No seu conjunto, os resultados este estudo demonstram que além do envolvimento no enovelamento proteíco, estas proteínas apresentam um conjunto de características particulares, provavelmente como resultado de funções específicas. Com a caracterização das funções celulares realizadas por estas proteínas, esperamos descobrir um pouco mais sobre o papel das imunofilinas em processos celulares fundamentais comuns a todos os eucariotas.

ABSTRACT: Immunophilins are intracellular receptors of immunosuppresive drugs, as cyclosporin, FK506 and rapamycin, found to possess peptidyl-prolyl cis-trans isomerase activity. In addition to their involvement in protein folding, new data demonstrate the participation of these proteins in specific cellular processes as signal transduction, protein trafficking and assembly and rDNA silencing. In this study we proposed to characterize the cellular functions of the immunophilins of the FKBP-type (FK506-binding proteins) identified in Neurospora crassa. In a search for the physiological role of these proteins we confirmed the cellular location of proteins FKBP13, FKBP22 and FKBP50 and determined the subcellular location of the FKBP11. We also analyzed the expression of these proteins in response to several stress inducers, performed immunoprecipitations and produced and analyzed single and multiple mutants for the fkbp genes. Using a GFP fusion protein and wild type protein extracts we confirmed the nuclear location of FKBP50, the endoplasmic location of FKBP22 and the mitochondrial and cytoplasmic location of FKBP13. We also determine that FKBP11 is located in cytoplasm. A more detailed biochemical analysis of these proteins revealed that FKBP11 is not expressed during vegetative development of the fungus but can be induced by high levels of calcium and during sexual development. Through immunoprecipitation using an antiserum against the FKBP13 we could coimmunoprecipitate a protein of approximately 40 kDa. Treatment of wild type mitochondrial and cytoplasmic protein extracts with different proteases showed that FKBP13 is highly resistant to proteolysis by proteinase K and trypsin. Phenotypic analysis of the FKBPs expression in response to several stress inducers revealed that FKBP50 might be down regulated by calcium. The FKBP22 levels were found to be specially elevated in response to osmotic and oxidative stress and FKBP13 levels can be found notably high in the presence of high amounts of FKBP11, suggesting a possible relation between FKBP13 and FKBP11. Although disruption of the fkbp11, fkbp13 and fkbp22 genes did not conducted to a detectable phenotype, disruption of the fkbp50 gene resulted in a temperature-sensitive phenotype. All together the results of this work showed that besides the involvement in protein folding these proteins present particular features, probably as a result of specific cellular functions. With the characterization of the cellular functions mediated by these proteins we expect to find out a little more about the role of immunophilins in fundamental cellular processes common to all eukaryotes.