Desenvolvimento de um sistema de diagnóstico molecular para microrganismos enológicos

Abstract

Com o aperfeiçoamento de técnicas moleculares, a sequenciação integral de genomas estendeu-se a uma maior diversidade de organismos, criando uma enorme quantidade de informação genética disponível à comunidade científica. Este conhecimento estimulou a elaboração de sistemas de técnicas moleculares para identificação, classificação e monitorização da abundância e diversidade de inúmeras espécies em ambientes complexos. Tornou-se necessário o desenvolvimento de ferramentas moleculares para realizar de forma rápida e fácil a enumeração de organismos presentes em amostras da indústria alimentar, para controlo de qualidade na linha de produção industrial, ou em amostras clínicas, possibilitando diagnósticos de infecções microbianas em tempo útil. Neste estudo, o processo fermentativo em mostos vínicos foi utilizado como modelo para validação do sistema de monitorização microbiana a desenvolver. A fermentação alcoólica é um processo altamente complexo e dinâmico, realizado por um vasto grupo de microrganismos, incluindo a levedura Saccharomyces cerevisiae, que é um dos mais importantes microrganismos usados na produção de vinhos. Seleccionou-se um grupo de leveduras e bactérias com relevo na fermentação de mostos, quer pela sua contribuição para o bouquet do vinho, quer pelo perfil deteriorante que podem exibir, e desenvolveram-se sondas específicas para detecção de cada uma das espécies por tecnologia de PCR. Optimizou-se também a extracção de DNA total dos mostos de fermentações espontâneas e provenientes de lagares e a técnica de PCR. Utilizou-se electroforese capilar na análise do ADN amplificado, que permitiu atingir uma sensibilidade de detecção de 5 células/ml. A aplicação da metodologia desenvolvida permitiu identificar as espécies de leveduras não- Saccharomyces e Saccharomyces e as bactérias mais relevantes dos mostos vínicos da Bairrada.

ABSTRACT: A large number of microbial full genome sequences are now available, providing a large amount of genetic information to the scientific community. This knowledge prompted the development of molecular tools for identification of microorganisms and for monitoring diversity and abundance of a wide range of species in complex environments. These molecular tools have direct application in the food industry for quality control during industrial production and in the clinique as rapid and accurate microbial infection diagnostics systems. In this study, fermentation of wine musts was chosen as a model to validate a microbial diversity monitoring system that we have developed. Alcoholic fermentation is a highly complex and dynamic process, conducted by a vast group of microorganisms, including the Saccharomyces cerevisiae, by far the most important yeast used in wine production. This and other yeasts and bacteria of relevance to the fermentation of wine musts were monitored in this study. Specific probes for the detection of these species by PCR technology were developed, and DNA extraction from musts obtained from spontaneous fermentations from Bairrada wine cellars was optimized. Capillary gel electrophoresis techniques were used for detection of amplified DNA and permitted detection sensitivity of 5 cells/ml. Most prevalent non-Saccharomyces and Saccharomyces strains and bacteria in musts were identified using the methodology developed in this project.