Funcional analysis of microtubule binding domain of MAST

Abstract

A Mast/Orbit/CLASP é uma família conservada de proteínas associadas aos microtúbulos (MAPs) essenciais para a organização e função do fuso mitótico (Inoue et al., 2000; Lemos et al., 2000; Akhmanova et al., 2001; Maiato et al., 2002; Maiato et al., 2003a; Mimori-Kiyosue et al., 2005). Estas proteínas surgem associadas aos microtúbulos, centrossomas e cinetocoros e diversos estudos sugerem que desempenham um papel importante na regulação das propriedades dinâmicas dos microtúbulos (Akhmanova et al., 2001; Maiato et al., 2002; Maiato et al., 2003a; Maiato et al., 2005). As isoformas humanas, CLASPs, fazem parte de um conjunto de proteínas (+TIPs) que exibem uma forte acumulação na ponta de crescimento (+) dos microtúbulos em polimerização (Schuyler and Pellman, 2001). Estas proteínas dissociam-se do polímero formado o que origina uma localização em forma de cometa na extremidade do microtúbulo. Neste trabalho mostramos que em Drosophila, a proteína Mast também é uma +TIP. Adicionalmente, definimos o domínio de ligação da proteína aos microtubulos e demonstrámos que, in vitro, a Mast se associa directamente com a tubulina num processo sensível a nucleótidos de guanina. O GTP favorece a ligação aos heterodímeros de tubulina, mas não influencia a ligação aos microtubulos. Contrariamente, o GDP inibe fortemente a ligação da Mast aos microtúbulos e heterodímeros de tubulina. Finalmente, provamos que a Mast liga e hidrolisa GTP, o que a torna a primeira +TIP com características de GTPase e sugere um novo mecanismo para a localização dinâmica das +TIPs. Estes resultados são consistentes com um modelo no qual a Mast-GTP copolimeriza com os heterodímeros de tubulina ou se associa directamente à extremidade (+) dos microtúbulos em crescimento. Após a associação ao microtúbulo dá-se a hidrólise do GTP e consequente formação de Mast-GDP que causará uma alteração conformacional da proteína promovendo a sua dissociação do microtúbulo. Este estudo sugere que uma proteína associada aos microtúbulos pode utilizar a actividade GTPásica na regulação da sua ligação aos microtúbulos.

Mast/Orbit/CLASP is a conserved MAP protein family essential for the organization and function of mitotic spindle (Inoue et al., 2000; Lemos et al., 2000; Akhmanova et al., 2001; Maiato et al., 2002; Maiato et al., 2003a; Mimori-Kiyosue et al., 2005). It accumulates at centrosomes, kinetochores and microtubule plus-ends where it is thought to regulate their dynamic properties (Akhmanova et al., 2001; Maiato et al., 2002; Maiato et al., 2003a; Maiato et al., 2005; Mimori-Kiyosue et al., 2005). CLASPs, the human homologues (Akhmanova et al., 2001), are members of the microtubule plus-end tracking protein (+TIP) family (Schuyler and Pellman, 2001). +TIPs show strong accumulation at the polymerizing end of microtubules, dissociating from the polymer soon afterwards giving the appearance of a comet-like structure. Here we show that the Drosophila homologue Mast also displays +TIP behaviour. Moreover, we defined the microtubule binding domain of Mast and showed that it associates directly with tubulin in a guanine nucleotide sensitive manner. GTP favours the binding of Mast to tubulin heterodimers but does not influence binding to microtubules, while GDP strongly inhibits the binding of Mast to microtubules. More importantly, we show that Mast can bind and hydrolyse GTP demonstrating that it is the first +TIP with this feature and hence suggesting a new mechanism for +TIP behaviour. These results are fully consistent with a model in which Mast-GTP copolymerizes with tubulin heterodimers at the growing microtubule plus end. Mast is then released from the polymer due to hydrolysis of the bound GTP, causing a conformational change of the protein that promotes its release from the microtubule lattice. Our data provides evidence that a microtubule associated protein could use its GTPase activity to regulate its ability to bind microtubules.