Development of decellularized-matrix based breast cancer 3D in vitro tumor models for therapeutic screening

Abstract

Impacting all stages of tumor progression and therapeutic efficacy, the breast cancer ECM is evermore recognized as a crucial component in breast cancer progression. However, despite the urgency in expediting the discovery and translation of novel effective breast cancer treatments, most preclinical in vitro models fail to recapitulate the complex interplay occurring in the three-dimensional tumor microenvironment (TME), especially in the context of cell and extracellular matrix (ECM) interactions. Despite the increasing adoption of 3D in vitro tumor models such as spheroids, these scaffold-free platforms still generally lack any prior representation of native ECM components of the TME. Alternatively, decellularized extracellular matrix (dECM)-based models are arising as valuable alternatives to bioengineer more physiomimetic tissue-specific and tumor-specific platforms within which cells can self-arrange and interact with ECM components, in a more biomimetic mode. Therefore, the main goal of this thesis was to drive forward the development of advanced 3D in vitro models of breast cancer, capable of more faithfully recapitulating the interactions established between breast cancer’s key ECM components and its heterotypic cellular landscape. A comprehensive overview of the changes in breast cancer TME landscape and on the importance of dECM-based biomaterials for in vitro tumor modeling is provided for contextualization of the current state-of-the art of the field. The bioengineering of breast cancer-stroma heterotypic spheroids is focused with the aim to demonstrate these model’s ability to serve as a platform to test living therapeutics. The screening of chemo-photothermal nanotherapeutic loaded mesenchymal stem cell (MSC) in 3D tumor models enabled to validate their tumoritropic delivery and access their preclinical performance. Seeking to advance breast cancer spheroid models, tissue-specific mammary dECM fibrillar fragments was then integrated within the process of spheroid formation, leading to new pathways for high-throughput compatible fabrication of ECM-enriched tumor spheroids. Lastly, an innovative methodology gathering on a fully exogenous enzyme free photoacoustic processing of breast-tissue specific dECM enabled the formulation of dECM inks and their processing into 3D living constructs by employing superhydrophobic surfaces and automated biofabrication technologies. Holistically, the newly developed methodologies provide means to generate high-throughput compatible 3D tumor models that more closely portray both stroma and ECM interactions with cancer cells. As such, given this approximation to more physiomimetic and predictive models, these are thus expected to accelerate the discovery of more effective therapeutic combinations by providing new grounds in which to preclinically analyze future therapies.

A matriz extra celular (ECM) do cancro da mama é incrementalmente vista como uma componente crucial para a progressão desta neoplasia. No entanto, apesar da urgência no desenvolvimento e descoberta de novas terapias, a maioria dos modelos de validação pré-clínica in vitro continuam a negligenciar a correta representação do micro ambiente tumoral tridimensional (TME). Falhando particularmente no contexto das dinâmicas de comunicação complexas estabelecidas as componentes celulares e matriciais do cancro da mama. Apesar do aumento na adoção de modelos 3D tumorais, tais como os esferoides de células tumorais, a generalidade destas plataformas apresenta uma representação deficiente da ECM tumoral. Alternativamente, modelos baseados na aplicação de matrizes extra celular descelularizadas (dECMs), começam a ser implementados como plataformas capazes de representar especificamente a complexidade matricial tumoral, onde as células se podem auto-organizar e interagir mais fidedignamente de uma perspetiva biológica. Como tal, o principal objetive da presente tese foi impulsionar o desenvolvimento de modelos 3D in vitro avançados de cancro da mama, capazes de recapitular fidedignamente interações estabelecidas entre os componentes matriciais do TME e a sua paisagem celular heterotípica. Procurando contextualizar o estado da arte, providencia-se uma visão geral de como a conceção espacial do TME do câncer de mama tem alterado, seguida de uma perspetiva em como as dECMs remodelaram nos últimos anos o campo da modelação tumoral in vitro. Devido ao impacto reconhecido das componentes estromais no sucesso terapêutico, a bioengenharia de esferóides heterotípicos contendo representação celular do estroma de cancro da mama foi incorrida com intuito de demonstrar a capacidade dos mesmo para servir como plataformas de teste de terapias celulares. A avaliação de nanoterapias quimio-fototérmicas com base em células mesenquimais estaminais (MSCs) permitiu validar não só a capacidade tumorotrópica das MSCs, como avaliar a sua performance num contexto de validação pré-clínica. Seguidamente, procurando avançar a capacidade de integração de dECM em modelos de esféricos tumorais, integrando fragmentos fibrilares dECM de origem de tecido mamário no processo de formação de esferóides. Esta metodologia permitiu desenvolver modelos mais representativos do microambiente matricial do cancro da mama num formato compatível com análise e produção em contexto de larga escala. Por último, utilizando uma nova abordagem de processamento foto-acústico demonstramos uma nova metodologia para processamento de dECMs, livre de qualquer uso de abordagens de digestão enzimática, e sua validação para metodologias distintas de cultura de células 3D e biofabricação automatizada. Globalmente, as metodologias desenvolvidas provaram servir como meios viáveis para gerar modelos 3D enriquecidos nas suas componentes matriciais e estrumais, provando ser compatíveis com metodologias de análise de elevado rendimento. Esperando-se, como tal, que ao providenciarem uma aproximação mais completa de algumas componentes do TME possam acelerar a descoberta e pré-validação de novas combinações terapêuticas mais eficazes.