Exploring the role of phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit type 3 on plasmacytoid dendritic cell activation

Abstract

Plasmacytoid dendritic cells (pDCs) are a subpopulation of dendritic cells specialized in the rapid and massive production of type-I interferon (IFN), upon triggering of their pattern recognition receptors (PRRs). They are crucial for effective immune responses, especially against viruses, while also reported to contribute to anti-tumor immunity if properly stimulated. On the other hand, dysregulation of pDCs activity has been implicated in the pathogenesis of autoimmune disorders and in cancer progression. The precise mechanisms regulating pDCs function are not yet fully understood. Phosphatidylinositol 3-kinase catalytic subunit type 3 (VPS34) is a protein crucial for both macroautophagy and endosomal trafficking, cellular processes that have been shown to influence PRRs activity. VPS34 operates in two different complexes, I and II, generators of phosphatidylinositol 3-phosphate (PI(3)P) at the nascent autophagosome and on early endosome membranes, respectively. However, the exact function of VPS34 on pDC responses has not been deciphered. Thus, the aim of this work was to study the role of VPS34 on pDC activation. For this purpose, a human pDC cell line, CAL-1, was used as a model. Cells were treated with the VPS34 inhibitor VPS34-IN1 in the absence of a stimulus or with concomitant PRR activation, either using the TLR7 agonist CL307 or the STING ligand 2’3’-cGAMP, and their response was analyzed. We found that VPS34-IN1 induces STING-dependent type-I IFN expression in unstimulated CAL-1. On the other hand, treatment with VPS34-IN1 impaired type-I IFN production mediated by TLR7 activation, mostly as a consequence of the disruption of VPS34 complex II/UVRAG-dependent processes. Interestingly, VPS34-IN1 impact on TLR7 signaling was mimicked by inhibition of SGK3, a protein known to be recruited to endosomes by VPS34, where it is activated. In contrast, VPS34-IN1 strongly potentiated STING signaling and subsequent IFN-β production triggered by 2’3’-cGAMP stimulation. This synergy occurred due to inhibition of translation by VPS34-IN1. Overall, the results suggest that VPS34 is involved in the regulation of pDC function, representing a potential target to manipulate the activity of these cells in autoimmune diseases linked to pDC anomalies, or to promote anti-tumor immune responses. In addition, our data indicate that SGK3 is important for efficient TLR7 signaling, which offers new strategies to control autoimmune syndromes driven by TLR7 hyperactivation.

As células dendríticas plasmacitóides (pDCs) são um grupo de células dendríticas especializadas na produção rápida e massiva de interferão (IFN) do tipo I, após activação dos seus receptores de reconhecimento de padrões (PRRs). As pDCs são cruciais para respostas imunes eficazes, especialmente contra vírus, existindo também evidências da sua contribuição para a resposta anti-tumoral quando devidamente estimuladas. Por outro lado, a desregulação da actividade das pDCs tem sido implicada na patogénese de doenças autoimunes e na progressão de cancros. Ainda não são totalmente compreendidos os mecanismos específicos que regulam a função destas células. A fosfatidilinositol 3-cinase subunidade catalítica tipo 3 (VPS34) é essencial para a macroautofagia e o tráfego endossomal, processos celulares que influenciam a actividade de PRRs. A VPS34 actua em dois complexos, o I e o II, produzindo fosfatidilinositol 3-fosfato (PI(3)P) nas membranas dos autofagossomas e dos endossomas iniciais, respectivamente. Contudo, a função exacta da VPS34 na resposta das pDCs ainda não foi decifrada. Assim, o objectivo deste trabalho foi estudar o papel da VPS34 na activação das pDCs. Para tal, foi usada como modelo uma linha celular de pDCs humanas, CAL-1. As células foram tratadas com VPS34-IN1, um inibidor da VPS34, unicamente ou em simultâneo com a activação de um PRR, usando CL307 (agonista do TLR7) ou 2’3’-cGAMP (agonista do STING), e a sua resposta foi analisada. Descobriu-se que o tratamento com VPS34-IN1, por si só, induz a expressão de IFNB1 em CAL-1, de uma forma dependente de STING. Além disso, a exposição a VPS34-IN1 inibiu a produção de IFN do tipo I mediada pela activação do TLR7, como consequência de defeitos em processos dependentes de UVRAG/complexo II da VPS34. O impacto do VPS34-IN1 na sinalização do TLR7 foi mimetizado pela inibição da SGK3, proteína recrutada pela VPS34 para os endossomas, onde é activada. Por outro lado, o VPS34-IN1 potenciou fortemente a sinalização de STING e consequente produção de IFN-β desencadeadas pela estimulação com 2’3’- cGAMP. Esta sinergia ocorreu devido à inibição da síntese de proteínas causada por VPS34-IN1. No geral, os nossos resultados sugerem que a VPS34 está envolvida na regulação da função das pDCs, representando um potencial alvo para manipular a actividade destas células em doenças autoimmunes, ou para promover respostas anti-tumorais. Adicionalmente, os nossos dados indicam que a SGK3 é importante para a sinalização eficiente do TLR7, o que oferece novas estratégias para controlar a autoimunidade causada pela hiperactivação do TLR7.