Dendritic cell-based vaccines: evaluating their anti-tumoral efficacy

Abstract

Dendritic cell (DC)-based antitumor vaccines have undergone significant development in the last decades and have proven to be a safe therapeutic approach. During the vaccine development process, it is important to monitor the ability of this strategy to elicit an effective immune response. An important parameter for determining their effectiveness is the assessment of their ability to (cross-)present antigens to cytotoxic T lymphocytes (CTLs). This can be assessed by several in vitro protocols, which are time-consuming, hence the need to establish a faster protocol. Therefore, in addition to optimizing the protocol currently used (mixed lymphocyte reaction - MLR) to evaluate this capability, it was also sought to implement an alternative protocol that requires less time and resources. The first aspect of optimizing the MLR assay involved replacing the culture medium used (X-VIVO 15) with a more readily available alternative (RPMI 1640). However, the results showed that RPMI 1640 medium did not increase T cell presentation and proliferation as effectively as X-VIVO 15 medium. Conversely, delaying IL-2 supplementation until day 7 of MLR contributed to a slight increase in the generation of antigen-specific CD8+ T lymphocytes (clones). Additionally, MLR restimulation with autologous peptide-loaded monocyte-derived DCs (moDCs) was also tested on days 7 and 10 of the assay. In this particular assay, a single restimulation was found to be more effective, as it resulted in higher number of clones. Furthermore, in addition to optimizing the MLR, the aim was also to replace the cytotoxicity detection method and thus increase its sensitivity. Of the two methods tested, flow cytometry was found to be the most sensitive compared to calcein-AM and the currently used lactate dehydrogenase (LDH) release assay. The alternative protocol for accelerated DCs testing focused on assessing the response of clones when co-cultured with moDCs loaded with the peptide for which these clones are specific. This response was assessed by measuring the levels of IFN-γ released by the stimulated clones. Preliminary testing demonstrated a correlation between these results and previous cytotoxicity testing data, reducing the test time to less than 48 hours. After confirming their functionality, expansion of these clones was also sought to establish a stock of pure cell population that could be used for further testing. For this purpose, in addition to an IL-2 stimulus and an anti-CD3 antibody, two types of feeder cells were also tested. Nevertheless, the use of these feeder cells proved to be suboptimal, which was reflected in a significant reduction in the purity of the clones. In sum, and since the optimization of laboratory protocols is a fundamental step in translational investigation, this study led to the optimization of certain procedures of the MLR assay by increasing its efficiency in assessing antigen presentation by moDCs. Furthermore, the increased sensitivity of the detection method potentially allows comparison of subtle differences between conditions, which was not possible with the LDH release assay. Finally, the alternative protocol tested provided promising results in significantly reduced the time and resources required for antigen presentation testing.

As vacinas anti tumorais baseadas em células dendríticas (CD) evoluíram significativamente nas últimas décadas, provando ser uma abordagem terapêutica segura. Durante o processo de desenvolvimento é importante monitorizar a capacidade destas para desencadear uma resposta imunitária eficaz. Um dos parâmetros utilizados consiste na avaliação da sua capacidade para as CDs realizarem apresentação cruzada (cross-presentation) de antigénios a linfócitos T citotóxicos (LTC). Existem vários protocolos in vitro que avaliam esta capacidade, contudo são muito morosos, daí a necessidade de estabelecer um protocolo mais célere. Assim, para além de otimizar o protocolo atualmente utilizado (reação mista de linfócitos - RML), procurou-se também implementar um protocolo alternativo que exigisse menos tempo e recursos. O primeiro ponto do RML a optimizar envolveu a substituição do meio de cultura utilizado (X-VIVO 15) por uma alternativa mais acessível (RPMI 1640). No entanto, os resultados mostraram que o meio RPMI 1640 não aumentou a apresentação e a proliferação das células T de forma tão eficaz como o meio X-VIVO 15. Por outro lado, o adiamento da suplementação com IL-2 até ao sétimo dia do RML contribuiu para um ligeiro aumento da geração de linfócitos T CD8+ específicos para o antigénio (clones). Também se testou a restimulação do RML com CDs derivadas de monócitos (moCDs) autólogos carregadas com péptidos nos dias 7 e 10 do ensaio. Neste ensaio específico, verificou-se que uma única restimulação proporcionava um aumento superior do número de clones. Outro objetivo foi substituir o método de deteção da citotoxicidade de forma a aumentar a sua sensibilidade. Dos dois métodos testados, a análise por citometria de fluxo provou ser mais sensível do que a calceína-AM e o ensaio de libertação de lactato desidrogenase (LDH), atualmente utilizado. O protocolo alternativo para acelerar a testagem da eficácia das CDs baseou-se na avaliação da resposta dos clones após co-cultura com moCDs carregadas com o péptido para o qual esses clones são específicos. Esta resposta foi avaliada através da medição dos níveis de IFN-γ libertados pelos clones estimulados. Os testes preliminares demonstraram uma correlação entre os resultados obtidos por este método e pelos testes de citotoxicidade anteriormente realizados, permitindo reduzir o tempo de testagem para menos de 48h. Depois de confirmar a sua funcionalidade, procurou-se também expandir estes clones de modo a formar um stock de células puras para testagens subsequentes. Para este efeito, para além do estímulo de IL-2 e de um anticorpo anti-CD3, foram também testados dois tipos de células de suporte (feeder cells). No entanto, a utilização destas células revelou-se insatisfatória, uma vez que se verificou uma redução significativa da pureza dos clones. Em suma, e uma vez que a otimização dos protocolos laboratoriais é um passo fundamental na investigação translacional, este estudo permitiu a otimização de determinados procedimentos do ensaio RML, aumentando a sua eficiência na avaliação da apresentação de antigénios por moCDs. Além disso, o aumento da sensibilidade do método de deteção poderá permitir a comparação de diferenças subtis entre condições, que não seria possível com o ensaio de libertação de LDH. Por último, o protocolo alternativo testado demonstrou resultados promissores, reduzindo significativamente o tempo e os recursos necessários para testar a apresentação de antigénios.