A lipidomic perspective of autoimmune diseases for the discovery of new biomarkers for personalize medicine

Abstract

Autoimmune diseases (AID) are chronic diseases with a high prevalence rate that affect approximately 4% of the world population and 5% of Portugal`s population. There are several different AID and the most common include multiple sclerosis (MSs), rheumatoid arthritis (RA), systemic lupus erythematosus (SLE) and systemic sclerosis (SS), which will be studied in this thesis. AID are debilitating diseases that make the patient incapable of living the normal daily life. It highly impacts the economy of both society and health care systems. The pathophysiological process of the majority AID is not fully understood, and each AID seems to have specific pathological features that are still mostly unknown. This leads to impaired proper diagnostic tools and lack of specific biomarkers for each disease, often preceding poorly diagnosed clinical situations. Feeling the urgent need for a new diagnostic approach (besides the immunological factors) as well as new and more specific biomarkers to ease the challenge of diagnosing AID, lipidomics can be seen as a new approach to face this challenge. This is supported by the few studies that have addressed some alterations in lipid profile in AID. Nonetheless, the alteration in lipid homeostasis in AID has been scarcely studied and most of the studies report data from enzymatic/colorimetric experiments. Very few addressed the changes in the lipidome of this type of pathologies through lipidomic analysis, which could give new knowledge on the lipid disturbances and adaptations in AID to fully elucidate the molecular mechanisms regulating lipid homeostasis in these pathologies. Hopefully it will be possible to propose new biomarkers as well as to design innovative therapeutic strategies in agreement with the nowadays so-called precision medicine. Thus, the main goal of the present Thesis was to fingerprint the plasma, serum, and whole blood lipidome of the most prevalent AID, namely MSs, SLE and SS, by using mass spectrometry (MS) based lipidomic approaches coupled to liquid chromatography (LC). It was intended to identify a specific lipidomic signature for lipid biomarkers discovery of each AID studied, hoping to improve precision and personalized medicine. Oxidation of lipid species, in particular cholesteryl esters, was also explored in an attempt to understand the lipid peroxidation process induced by oxidative stress conditions, which are characteristic of AID. An additional objective of this Thesis was to ascertain dried blood spots (DBS) as an alternative pre-analytical approach for clinical lipidomic analysis. Following the main goal of this Thesis, and to gain a more in-depth knowledge on AID, lipidomic analysis of serum from MSs patients, comparing with healthy controls, showed that the lipid profile changes with disease status and the lipid species phosphatidylcholine [PC (38:1)] could be a possible biomarker of this disease. In addition, the whole blood and plasma of patients diagnosed with SLE or SS diseases were studied and it was determined that PC(38:1) may not be an exclusive marker for multiple sclerosis but instead for AID, once its abundance was altered in both SLE and SS as well. Sphingomyelin and ceramides content in plasma of SS was shown to be upregulated and could be used as specific markers of this AID.The correlation between inflammation, oxidative stress, and lipids in AID was evaluated in the case of RA. It was performed a review of the literature regarding RA, one of the most prevalent AID, and known to be correlated with lipid alteration and increased oxidative stress. However, the major work was focused on the alterations of the fatty acid profile and only few in lipidomic studies, but giving evidence of alteration of some phospholipid species, such as PC and phosphatidylinositols, and few oxidized lipid species like hydroxyeicosatetraenoic acids and hydroxyoctadecadienoic acids. In an attempt to optimize MS-based approaches for the identification of oxidized lipids in AID, oxidized cholesteryl ester species were synthesised and characterized by LC-MS/MS, and the specific fragmentation fingerprinting was identified, which will be useful for their identification in oxidative stress related diseases such as AID. Furthermore, DBS were evaluated to meet the purpose of the development of a less invasive method for lipidomic analysis in AID. Initially a bibliographic revision of DBS applications in lipidomics was performed and key procedures and interferences were highlighted, as well as few previous findings on these subjects. There is no consensus on this topic and efforts should be made to harmonize and standardize the procedures/protocols used to apply this blood collection method on routine clinical lipidomic analysis. Lastly, the lipid profile of healthy children was evaluated using DBS samples. The lipid profile was shown to change with age and the method used to extract and analyse the lipids from the DBS was proven efficient, meaning that the use of DBS method can be further exploited to the study of AID. Nowadays, there is an urgent need for strategies that provide disease and disease-state markers suitable for accurate diagnosis, timely intervention and a better disease management, especially in multifactorial diseases and of complex diagnosis like AID. This Thesis tried to meet health challenges, creating opportunities for good health, well-being, and healthcare, by contributing to the evolution of knowledge concerning AID lipidomic signatures and the possible use of DBS as a substitute of conventional samples, all contributing to the innovative method of precision medicine. Personalized/precision medicine would benefit from the tailored early diagnosis of relapse episodes, aided by lipidomic analysis, to promote a more effective treatment to each AID patient.

As doenças autoimunes (DAI) são doenças crónicas com uma elevada taxa de prevalência que afetam cerca de 4% da população mundial e 5% da população portuguesa. Existem várias DAI dentro das quais as mais comuns incluem a esclerose múltipla (do inglês multiple sclerosis, MSs), artrite reumatóide (do inglês rheumatoid arthritis, RA), lúpus eritematoso sistémico (do inglês systemic lupus erythematosus, SLE) e esclerose sistémica (do inglês systemic sclerosis, SS) que serão estudadas nesta Tese. As DAI são doenças debilitantes que tornam o paciente incapaz de viver a vida diária normal e têm um grande impacto na economia da sociedade e dos sistemas de saúde. O processo fisiopatológico da maioria das DAI não é totalmente compreendido, e cada DAI parece ter características patológicas específicas que ainda são desconhecidas, o que conduz ao uso de ferramentas de diagnóstico inadequadas e à falta de biomarcadores específicos para cada doença, muitas vezes precedendo situações clínicas incorretamente diagnosticadas. Sentindo a necessidade urgente de uma nova abordagem de diagnóstico (além dos parâmetros imunológicos) e de novos e mais específicos biomarcadores para amenizar o desafio de diagnosticar as DAI, a lipidómica pode ser vista como uma nova ferramenta para enfrentar este desafio, o que é corroborado pelos poucos estudos que abordam alterações do perfil lipídico nas DAI. No entanto, a alteração da homeostase lipídica nas DAI tem sido pouco estudada e a maioria dos estudos relata dados de ensaios enzimáticos/colorimétricos. Muito poucos referem as alterações no lipidoma deste tipo de patologias através da análise lipidómica, o que poderia fornecer novos conhecimentos sobre os distúrbios e adaptações lipídicas nas DAI para elucidar completamente os mecanismos moleculares que regulam a homeostase lipídica nestas patologias. Espera-se que seja possível propor novos biomarcadores, bem como desenhar estratégias terapêuticas inovadoras de acordo com a nova “medicina de precisão”. Assim, o principal objetivo da presente Tese consistiu na identificação do lipidoma de plasma, soro e sangue total das DAI mais prevalentes, nomeadamente MSs, SLE e SS, usando abordagens lipidómicas baseadas em espectrometria de massa (do inglês mass spectrometry, MS) acoplada à cromatografia líquida (do inglês liquid chromatography, LC). Pretendeu-se identificar uma assinatura lipidómica específica para a descoberta de biomarcadores lipídicos de cada DAI estudada, na esperança de melhorar a medicina personalizada e de precisão. A oxidação de espécies lipídicas, em particular os ésteres de colesterol, também foi objeto de estudo, na tentativa de entender o processo de peroxidação lipídica induzida por condições de stress oxidativo características das DAI. Um objetivo adicional desta Tese foi determinar a viabilidade do sangue seco em cartão (do inglês dried blood spots, DBS) como uma abordagem pré-analítica alternativa para a análise lipidómica clínica. Seguindo o objetivo principal desta Tese, e para obter um conhecimento mais aprofundado sobre as DAI, a análise lipidómica do soro de pacientes com MSs, comparando com controlos saudáveis, mostrou que o perfil lipídico muda com o estado da doença e a espécie lipídica fosfatidilcolina [PC (38:1)] poderia ser um possível biomarcador desta doença. Além disso, estudou-se sangue total e plasma de pacientes diagnosticados com SLE e SS, onde se determinou que a espécie PC(38:1) pode não ser um marcador exclusivo para a MSs, mas sim para as DAI, uma vez que a sua abundância estava alterada em ambas SLE e SS. O conteúdo de esfingomielina e ceramidas no plasma de SS mostrou-se aumentado, podendo ser considerado o seu uso como marcadores específicos desta DAI.A correlação entre inflamação, stress oxidativo e lípidos nas DAI foi avaliada no caso da RA. Foi realizada uma revisão da literatura a respeito da RA, uma das DAI mais prevalentes, e onde já foram reportadas alterações lipídicas relacionadas com o aumento do stress oxidativo. No entanto, o foco das investigações tem sido nas alterações do perfil de ácidos gordos, existindo apenas alguns estudos com aplicação de abordagens lipidómicas. Todavia, há evidências de alteração de algumas espécies de fosfolípidos, como PC e fosfatidilinositóis, e algumas espécies de lípidos oxidados, como os ácidos hidroxieicosatetraenóicos e os ácidos hidroxioctadecadienóicos. Numa tentativa de otimizar as abordagens baseadas em MS para a identificação de lípidos oxidados nas DAI, foram sintetizadas espécies de éster de colesterol oxidado e caracterizadas por LC-MS/MS. Foi determinada a sua fragmentação específica, o que será útil para a identificação destas espécies em doenças relacionadas com stress oxidativo, como é o caso das DAI. Além disso, os DBS foram avaliados para atender ao propósito do desenvolvimento de um método menos invasivo passível de ser aplicado na análise lipidómica das DAI. Inicialmente, foi realizada uma revisão bibliográfica das aplicações dos DBS na lipidómica onde foram destacados os principais procedimentos e interferências, bem como alguns resultados já descritos sobre este assunto. No entanto, não há consenso sobre este tema e devem ser feitos esforços para harmonizar e padronizar os procedimentos/protocolos utilizados de forma a aplicar este método de colheita de sangue em análises de lipidómica clínica de rotina. Por último, o perfil lipídico de crianças saudáveis foi avaliado usando amostras de DBS, que mostrou variar com a idade. O método utilizado para extrair e analisar os lipídios dos DBS mostrou-se eficiente, o que significa que o uso do método DBS pode ser aplicado no futuro para o estudo das DAI. Atualmente, são necessárias estratégias que forneçam marcadores da doença e do estado da doença adequados a um diagnóstico preciso, uma intervenção oportuna e uma melhor gestão da doença, especialmente em doenças multifatoriais e de diagnóstico complexo como as DAI. Esta Tese tentou ir ao encontro dos desafios da saúde, criando, por um lado, oportunidades para uma vida mais salutar, repleta de bem-estar e cuidados adequados. Por outro lado, contribui para a evolução do conhecimento sobre as assinaturas lipídicas das DAI e o possível uso dos DBS como substituto das amostras convencionais, todos contribuindo para o inovador método da medicina de precisão. A medicina personalizada/de precisão beneficiaria do diagnóstico precoce personalizado de episódios de recaída, auxiliado pela análise lipidómica, para promover um tratamento mais eficaz para cada paciente com DAI.