Assessment of fate and effects of metal and metal oxide nanomaterials in freshwater organisms

Abstract

Engineered nanomaterials (ENMs), namely silver (Ag) and copper oxide (CuO) ENMs, are widely applied in diverse fields such as biomedical, sensors, food packaging, textiles, cosmetics, environmental remediation, etc. Through different pathways, these ENMs might enter in freshwater ecosystems and affect aquatic biota, in particular plants and fish. Although their bulk counterparts (salt metals) have well known mechanisms of toxicity, it is crucial to understand if the nano scale properties result in distinct effects to freshwater organisms. Thus, the main objective of this thesis was to assess the effects of ENMs to aquatic biota, using silver (Ag) ENMs and copper oxide (CuO) ENMs as representatives of metal (Me) and (MeO) ENMs, respectively. This work focused on the effect of different characteristics of ENMs (e.g. surface coating) on their toxicity to the aquatic organisms Lemna minor and zebrafish (Danio rerio), as model species of aquatic plants and fish. In particular, this work aimed to address the following questions: Are ENMs more toxic than the respective salt metals (AgNO₃ and CuSO₄)? Is toxicity of Ag ENMs affected by their characteristics (e.g. surface coatings as citrate or polyvinylpyrrolidone (PVP))? Do the effects of Ag ENMs to L. minor change over time? Are the effects of both Ag ENMs and CuO ENMs similar to zebrafish embryos? Can chorion hinder the entry of ENMs inside fish embryos? Do ENMs induce osmoregulatory stress in fish embryos and oxidative stress in both model organisms? Experimental data showed that ENMs were less toxic than the respective salt metals (AgNO₃ and CuSO₄) in both species, L. minor and zebrafish. Surface coating influenced Ag ENMs effects in L. minor, as citrate affected more pronouncedly Guaiacol peroxidase (GPox) and Glutathione-S-transferase (GST) activities, whereas PVP influenced more the growth rate and the number of fronds per colony. The effects of Ag ENMs to L. minor changed over time, as an ameliorative effect was noticed after 14 days (d) of exposure, compared to 7d of exposure. In zebrafish embryos, chorion had a protective effect against ENMs. Indeed, bioavailability of both Ag ENMs and CuO ENMs to the zebrafish embryos was very low, where most of total metal (>99% and 94%, respectively) was associated to the chorion. the same trend that occurred for AgNO₃ (96% of total metal), but not for CuSO₄, where only 58% (total metal) was associated to the chorion. Osmoregulatory stress showed a nano-specific effect (i.e. more significant effects in ENMs than in the salt metal) for Ag ENMs but not for CuO ENMs. Moreover, a mild oxidative stress was triggered by both Ag and CuO ENMs, where a depletion of total glutathione (GSH) also had a nano-specific effect. Overall, results suggest that ENMs tend to be less toxic than the respective salt metals, and highlight their ability to cause oxidative stress to both aquatic species, further showing that some toxic effects are nano-specific. The lower toxicity of Ag ENMs compared to the bulk salt was further confirmed using Species Sensitive Distributions (SSD). The hazardous concentration for 5% of species (HC₅) values was 13-fold lower for Ag NMs than for AgNO₃ (0.089 μg L⁻¹ and 0.007 μg L⁻¹, respectively). The most sensitive species for both Ag forms were cladocerans (Daphniidae). Predicted no effect concentration (PNEC) values were 0.045 μg L⁻¹ for Ag ENMs and 0.007 μg L⁻¹ for AgNO₃. Risk quotient (RQ) was 6.3 (>1) for AgNO₃ and 0.03 for Ag ENMs (<1), which suggests that the existing metal risk assessment could be extrapolated to the ENMs. Nevertheless, ENMs have a distinct mechanism of action than the salt metals. Furthermore, the diversity of ENMs characteristics (e.g. surface coating) requires further toxicological studies aiming to improve the knowledge on ENMs toxicity and risk assessment.

Os nanomateriais de síntese (ENMs), nomeadamente de prata (Ag) e óxido de cobre (CuO), são amplamente utilizados em diversos campos, como biomedicina, sensores, embalagens de alimentos, têxteis, cosméticos, remediação ambiental, etc. Através de diferentes vias, entram nos ecossistemas dulçaquícolas e afetam a biota aquática, em particular plantas e peixes. Embora os respetivos sais metálicos tenham mecanismos de toxicidade bem conhecidos, é crucial entender se as propriedades da escala nano resultam em efeitos distintos nos organismos dulçaquícolas. Assim, o principal objetivo desta tese foi avaliar os efeitos das ENMs na biota aquática, usando ENMs de prata (Ag ENMs) e ENMs de óxido de cobre (CuO ENMs) como representantes de ENMs metálicas (Me) e ENMs de óxido metálico (MeO), respectivamente. Este trabalho focou-se no efeito de diferentes características dos ENMs (por exemplo, revestimento de superfície) na toxicidade para os organismos aquáticos Lemna minor e zebrafish (Danio rerio), como espécies modelo de plantas aquáticas e peixes. Em particular, este trabalho visou abordar as seguintes questões: os ENMs são mais tóxicos do que os respectivos sais metálicos (AgNO₃ e CuSO₄)? A toxicidade de Ag ENMs é afectada pelas suas características (por exemplo, revestimentos superficiais como citrato ou polivinilpirrolidona (PVP))? Os efeitos dos Ag ENMs sobre a L. minor mudam com o tempo? Os efeitos dos Ag ENMs e de CuO ENMs no organismo dos embriões de peixe-zebra são semelhantes entre si? O córion pode impedir a entrada de ENMs dentro de embriões de peixes? Os ENMs induzem stress osmorregulatório em embriões de peixe e stress oxidativo em ambos os organismos modelo? Os dados experimentais mostraram que os ENMs foram menos tóxicos do que os respetivos sais metálicos em ambas as espécies, L. minor e peixe-zebra. O revestimento superficial influenciou os efeitos dos ENMs de Ag na L. minor, pois o citrato afetou mais pronunciadamente as atividades da guaiacol peroxidase (GPox) e glutationa-S-transferase (GST), enquanto que o PVP influenciou mais a taxa de crescimento e o número de frondes por colónia. Os efeitos dos Ag ENMs sobre a L. minor mudaram ao longo do tempo, pois após 14 dias (d) de exposição foi notado um efeito atenuador, comparativamente aos 7d de exposição.O córion dos embriões de peixe-zebra teve um efeito protetor contra ENMs. De fato, a biodisponibilidade de Ag ENMs e de CuO ENMs nos embriões de peixe-zebra foi muito baixa, onde a maior parte do metal total (>99% e 94%, respetivamente) foi associada ao córion; a mesma tendência que ocorreu para AgNO₃ (96% do metal total), mas não para CuSO₄, onde apenas 58% (metal total) estava associado ao córion. O stress osmorregulatório mostrou um efeito nanoespecífico (ou seja, efeitos mais significativos nos ENMs do que no sal metálico) para Ag ENMs, mas não para CuO ENMs. Além disso, os Ag ENMs e os CuO ENMs desencadearam stress oxidativo moderado, onde a depleção de glutationa (GSH) total também teve um efeito nanoespecífico. No geral, os resultados sugerem que os ENMs tendem a ser menos tóxicos do que os respetivos sais metálicos e destacam a sua capacidade de causar stress oxidativo para ambas as espécies aquáticas, mostrando ainda que alguns efeitos tóxicos são nanoespecíficos. A menor toxicidade dos Ag ENMs em comparação com o sal metálico foi ainda confirmada usando a Distribuição da Sensibilidade das Espécies (SSD). O valor da Concentração Perigosa para 5% das Espécies (HC₅) dos Ag ENMs foi 13 vezes inferior ao do AgNO₃ (0,089 μg L⁻¹ e 0,007 μg L⁻¹, respetivamente). As espécies mais sensíveis para ambas as formas de Ag foram os cladóceros (Daphniidae). A Concentração para a qual Não se Prevê a ocorrência de um Efeito (PNEC) foi 0,045 μg L⁻¹ para os Ag ENMs e 0,007 μg L⁻¹ para AgNO₃. O quociente de risco RQ foi de 6,3 (>1) para o AgNO₃ e 0,03 para os Ag ENMs (<1), sugerindo que a avaliação de risco existente para metais poderá ser extrapolada para os ENMs. No entanto, os ENMs têm um mecanismo de ação distinto dos sais metálicos. Além disso, a diversidade de características dos ENMs (por exemplo, revestimento superficial) requer mais estudos toxicológicos com o objetivo de melhorar o conhecimento sobre a toxicidade e avaliação de risco dos ENMs.