Advanced and innovative simulated moving bed strategy for the isolation of ternary mixtures of triterpenic acids

Abstract

Biomass residues are increasingly acknowledged to have the potential to replace a large fraction of nonrenewable resources due to their abundance and relative low cost. These residues are a source of natural products with enormous structural and chemical diversity and high added value. Triterpenic acids (TTAs), namely, betulinic, oleanolic and ursolic acids have attracted great research attention due to their wide spectrum of pharmacological and nutraceutical properties. These compounds are ubiquitous in nature and can be found and extracted in relatively high quantities from the outer bark of Eucalyptus globulus, which is a high-volume residue from the pulp and paper industry. Nonetheless, their isolation after extraction is challenging due to their similar molecular structures. The simulated moving bed (SMB) is a continuous chromatographic separation technique that, by operating countercurrently, maximizes the mass transfer driving force, allowing the separation of compounds with low selectivities as, for instance, enantiomers. While a conventional SMB for binary separations is based on a four-zone configuration with synchronous switching of the two inlets and two outlets streams, this technology has been modified continuously through, for example, the addition of inlet and outlet streams, changing the number of zones, and varying concentrations and flow rates to expand its range of application. This thesis includes a detailed review of the most recent SMB strategies. The selection of adsorbents and eluents (or mobile phases) is of primordial importance for the successful operation of an SMB. In this way, a critical literature review covering the solubility of the three TTAs (in unary solvents and mixtures), all types of adsorbents reported for their separation – from commercial adsorbents (C18, C30 and graphite columns) to custom materials (molecularly impressed polymers and others) – eluents (conventional HPLC solvents and super/subcritical fluids), mobile phase modifiers (acidic, basic and cyclodextrins), pre-column derivatization strategies, and the influence of temperature was accomplished. The main results are thoroughly discussed in terms of calculated separation selectivities. The solubilities of TTAs are low in many solvents, increasing with temperature and decreasing sharply with the addition of small quantities of water. Best separation selectivities were obtained with porous graphitic columns. The separation of betulinic, oleanolic and ursolic acids was studied in a first instance at analytical scale with columns Apollo C18, Spherisorb S5, Spherisorb S10 and Acclaim C30 with eluents like methanol, acetonitrile, water, ethanol, isopropanol, ethyl acetate, acetone and mixtures thereof. It was demonstrated that the separation of betulinic and oleanolic acids is fostered with mobile phases containing acetonitrile and methanol (in comparison with pure methanol) for all columns, and that the Acclaim C30 provides the highest selectivities with methanol/acetonitrile 50/50 (%, v/v) emerging as the best mobile phase. In the case of the separation of oleanolic and ursolic acids, the modification of methanol with acetonitrile did not improve selectivity, and the best results were obtained with the column Acclaim C30 and methanol/water 95/5 (%, v/v). The equilibrium and transport parameters for pure TTAs were determined through breakthrough experiments and the method of moments, and were then validated with breakthrough experiments of TTAs binary mixtures. The SMB separations of representative mixtures of natural extracts containing these TTAs were optimized using a design of experiments and surface response methodology combined with phenomenological modeling. The results demonstrated that it is possible to produce betulinic, oleanolic and ursolic acids with purities above 99 % by SMB chromatography. This work culminated with the assembly and start-up of a customized versatile SMB unit. The unit follows a one valve per column configuration (1ST1C) and all its aspects were carefully addressed, from the user interface to the assembly and internal configuration of the valves, and flow rate control. Preparative imChem Surf C30 columns were acquired and carefully characterized in terms of their packing and retention towards the three TTAs. The equilibrium and transport parameters of each TTA were measured by breakthrough experiments with a mobile phase of methanol/water 95/5 (%, v/v; 0.1 % formic acid). The SMB separation of a representative mixture of natural extracts containing betulinic and oleanolic acids was optimized for a minimum purity of 99 %, and various separation experiments were accomplished with four and three zone configurations.

Os resíduos de biomassa são vistos cada vez mais como potenciais substitutos de recursos não renováveis devido à sua abundância e relativo baixo custo. Estes resíduos são uma fonte infindável de compostos naturais com uma enorme variedade estrutural e de elevado valor acrescentado. Os ácidos triterpénicos (TTA), em particular, os ácidos betulínico, oleanólico e ursólico, têm atraído grande interesse devido ao seu variado conjunto de propriedades farmacológicas e nutracêuticas. Estes compostos encontram-se em várias matrizes naturais vegetais e podem ser extraídos em quantidades consideráveis da casca externa de Eucalyptus globulus, que é um resíduo abundante da indústria da pasta e papel. Contudo, o isolamento molecular de cada um dos ácidos triterpénicos após extração é uma tarefa difícil devido às suas estruturas moleculares semelhantes. O leito móvel simulado (SMB) é uma técnica cromatográfica de separação em contínuo que, por operar em contracorrente, maximiza a força motriz para a transferência de massa, permitindo separações de compostos pouco seletivos, como, por exemplo, enantiómeros. Enquanto um SMB convencional para separações binárias assume uma configuração de quatro zonas, com comutações sincronizadas das duas correntes de entrada e duas de saída, esta tecnologia tem vindo a sofrer alterações a nível do número de correntes de entrada e saída, do número de zonas, e de concentrações e caudais, por exemplo, por forma a expandir a sua gama de utilização. Esta tese inclui uma revisão detalhada das estratégias mais recentes de separação cromatográfica em leito móvel simulado. A seleção de adsorventes e eluentes (ou fases móveis) é de extrema importância para uma operação bem sucedida em SMB. Desta forma, foi efetuada uma revisão crítica da literatura, abordando a solubilidade dos três TTA mencionados (em solventes puros e misturas), todo o tipo de adsorventes reportados para a sua separação – desde adsorventes comerciais (C18, C30 e colunas de grafite) a adsorventes específicos (polímeros molecularmente impressos e outros) – eluentes (solventes líquidos típicos de cromatografia e fluidos sub/supercríticos), modificadores de fase móvel (modificadores ácidos, básicos, e ciclodextrinas), estratégias de derivatização pré-coluna, e a influência da temperatura. Os principais resultados estão discutidos em termos de seletividades calculadas. As solubilidades dos TTA são relativamente baixas para vários solventes, aumentando com a temperatura e diminuindo abruptamente com a adição de pequenas quantidades de água. As melhores seletividades de separação foram obtidas com colunas de grafite porosas. A separação dos ácidos betulínico, oleanólico e ursólico foi estudada numa primeira fase à escala analítica com colunas Apollo C18, Spherisorb S5, Spherisorb S10 e Acclaim C30, usando eluentes como metanol, acetonitrilo, água, etanol, isopropanol, acetato de etilo, acetona e misturas destes solventes. Demonstrou-se que a separação dos ácidos betulínico e oleanólico é promovida pela utilização de fases móveis de acetonitrilo e metanol (em comparação com metanol puro) para todas as colunas e que com a coluna Acclaim C30 se obtêm as maiores seletividades de separação, tendo-se definido como melhor fase móvel a mistura metanol/acetonitrilo 50/50 (%, v/v). No caso da separação dos ácidos oleanólico e ursólico, a modificação de metanol com acetonitrilo não aumentou a seletividade, e os melhores resultados foram obtidos com a coluna Acclaim C30 e metanol/água 95/5 (%, v/v). Foram determinados os parâmetros de transporte e equilíbrio através de experiências de curva de rutura e do método dos momentos para os TTA puros, validando-se posteriormente estas constantes com experiências de curva de rutura para misturas binárias dos ácidos. As separações em SMB de misturas representativas de extratos naturais contendo estes TTA foram otimizadas, usando a metodologia de desenho fatorial de experiências e respostas de superfície combinada com simulações fenomenológicas. Os resultados permitiram concluir que é possível produzir os ácidos betulínico, oleanólico e ursólico com purezas acima de 99 % por cromatografia em leito móvel simulado. Este trabalho culminou com a montagem e arranque de uma unidade laboratorial versátil de SMB. A unidade segue uma configuração de uma válvula por coluna (1ST1C) e todos os seus aspetos foram abordados, desde a interface de utilizador à montagem e configuração interna das válvulas, passando pelo controlo de caudais. Foram adquiridas e cuidadosamente caracterizadas colunas preparativas imChem Surf C30 em termos de empacotamento e retenção em relação aos três TTA. Foram medidos os parâmetros de transporte e equilíbrio de cada TTA através de experiências de curva de rutura com fase móvel de metanol/água 95/5 (%, v/v; 0.1 % ácido fórmico). A separação em leito móvel simulado de uma mistura representativa de extratos naturais contendo os ácidos betulínico e oleanólico foi otimizada para uma pureza mínima de 99 % e foram conduzidas várias experiências de separação com configurações de quatro e três zonas.