Ion effects on protein model compounds in aqueous systems: experimental and computational studies

Abstract

Aqueous solutions containing electrolytes are the natural environment of many biomolecules, playing an important role in regulating their structure and physico-chemical behaviour, governing numerous biochemical processes. The knowledge of the solubility of amino acids, peptides, and proteins in the pres-ence of salts is therefore of utmost importance from a biological perspective in many food and pharmaceutical applications. Even if relevant data on amino ac-ids solubility in aqueous electrolyte solutions can be found, the gaps are evident, particularly for aromatic amino acids and those presenting more than one amino or carboxylic group. This Thesis considers the solubility of glycine, L-leucine, L-phenylalanine, and L-aspartic acid in aqueous solutions of the salts composed by combining the monovalent (Na⁺, K⁺, NH₄⁺) cations with the Cl⁻, NO₃⁻ and SCN⁻ anions and di-valent (Mg²⁺ and Ca²⁺) cations with the Cl⁻, NO₃⁻ anions, and also the solubility of L and DL isomers of valine in aqueous NaNO₃ and KNO₃ solutions. Additionally, the salt effect on the solubility of the amino acids: L-glutamic acid, L-tryptophan, and L-tyrosine, rarely found in the literature, were carried out in aqueous solutions of KCl and (NH₄)₂SO₄, salts for which much information can be found allowing for a better rationalization of the data. All the measurements were performed at 298.2 K with molality up to 2 mol/kg. The isothermal shake-flask method combined with the gravimetric, UV spectros-copy, or refractive index measurements was used for compositional analysis. To examine any changes in the amino acids crystallographic form, supplemen-tary solid phase studies were realized. The pH of the saturated solution was also measured. The monovalent cations did not seem to establish relevant interac-tions with the amino acids and had a much lower impact on their aqueous solu-bility than divalent cations, being Ca²⁺ the one showing a more pronounced ef-fect. For all anions, except the sulfate, the solubility effect follows the Hofmeister series. In general, amino acids with apolar side chains had lower solubility than those with polar groups. After investigating the impact of inorganic salts on the solubility of amino acids, the impact of a salt with an organic anion (tosylate) also was studied, and a salting-in effect was observed. Besides, the solubility-pH dependence studies for glycine and two peptides containing this amino acid; diglycine and N-acetylglycine, were performed in water and 1 molal Na₂SO₄ solution. The electrolyte perturbed-Chain Statistical Association Theory (ePC-SAFT) was applied to describe the AA solubility in mixtures of water + L-glutamic acid/ L-aspartic acid/ L-tryptophan/ L-tyrosine + KCl/ (NH₄)₂SO₄.

Soluções aquosas contendo eletrólitos são o ambiente natural de muitas biomoléculas, desempenhando um papel importante na regulação de sua estrutura e comportamento físico-químico, governando inúmeros processos bioquímicos. O conhecimento da solubilidade de aminoácidos (AA), peptídeos e proteínas na presença de sais é, portanto, de extrema importância do ponto de vista biológico e de relevo em muitas aplicações das indústrias alimentar e farmacêutica. Mesmo que dados relevantes sobre a solubilidade de AA em soluções aquosas de eletrólitos possam ser encontrados, as lacunas são evidentes, principalmente para AA aromáticos e aqueles que apresentam mais de um grupo amino ou carboxílico. Esta Tese considera a solubilidade da glicina, L-leucina, L-fenilalanina e ácido L-aspártico em soluções aquosas dos sais compostos pela combinação dos catiões monovalentes (Na⁺, K⁺, NH₄⁺) com os aniões Cl⁻, NO₃⁻ e SCN⁻, e os catiões divalentes (Mg²⁺ and Ca²⁺) com os aniões Cl⁻, NO₃⁻, tendo ainda sido avaliada a solubilidade dos isómeros L e DL da valina em soluções aquosas de NaNO₃ e KNO₃. Adicionalmente, o efeito salino na solubilidade dos ácido L-glutâmico, ácido L-aspártico, L-triptofano e L-tirosina, raramente encontrados na literatura, foi realizado em soluções aquosas de KCl e (NH₄)₂SO₄, sais em que é abundante a informação com outros aminoácidos, permitindo interpretações mais completas. Todas as medidas foram realizadas a 298.2 K com molalidade do sal até 2 mol/kg. O método isotérmico dos frascos com agitação foi combinado com os métodos gravimétrico, espectroscopia UV, ou indíce de refração para análise da composição. Para examinar eventuais alterações na forma cristalográfica dos aminoácidos, foram realizados estudos complementares de fase sólida. Foi ainda medido o pH da solução saturada. Os catiões monovalentes não pareceram estabelecer interações relevantes com os AA e apresentam um impacto muito menor na solubilidade dos AA do que os catiões divalentes, sendo o Ca²⁺ aquele com efeito mais pronunciado. Excetuando o sulfato, os aniões seguem a série de Hofmeister. Em geral, AA com cadeias laterais apolares apresentaram solubilidade menor do que aqueles com grupos polares. O impacto de um sal com um anião orgânico (tosilato) foi também estudado, apresentando o maior efeito de salting-in entre todos os sais de sódio. Além disso, os estudos de dependência solubilidade com o pH para a glicina, diglicina e N-acetilglicina, foram realizados em água e em solução 1 molal de Na₂SO₄. A equação de estado ePC-SAFT foi ainda aplicada na descrição das solubilidade dos AA nas misturas de água + ácido L-glutâmico/ácido L-aspártico/L-triptofano/L-tirosina + KCl/ (NH₄)₂SO₄.