Chemical characterization and biological evaluation of residual biomass extracts from Eucalyptus globulus and Acacia dealbata

Abstract

Currently, there is a growing interest in the exploitation of agro-forest biomass by-products as a source of compounds with biological or nutraceutical properties, making them suitable for use in a wide range of added value applications such as in pharmaceutical, cosmetic and/or food sectors. The recovery of these compounds can be combined with one of the most important sectors in the Portuguese economy, that is, the agroforest industrial exploitation of Eucalyptus globulus associated with pulp and paper production, which generates high amounts of residual biomass. In addition, there are invasive species, such as Acacia dealbata that are also considered as biomass waste during forest management. As such, the detailed characterization of the extractive fractions of these residual biomasses, the development of sustainable extraction processes and the evaluation of their biological activities might lead to the development of new added value applications and contribute to the sector's profitability. In this study, the lipophilic fractions of E. globulus leaves and A. dealbata bark, wood and leaves were characterized in detail by gas chromatography coupled to mass spectrometry (GC–MS), and the bioactive potential of the extracts was evaluated in order to envisage new pathways for their valorization. The polar fractions were also studied in terms of total phenolic (TPC) and proanthocyanidins (PC) contents and antioxidant potential. In a strategy aiming at developing an integrated process for the exploitation of essential oil and triterpenic acids from eucalyptus leaves the latter fraction was analyzed before and after hydrodistillation, and its extraction with essential oil (EO) and 1,8-cineole (CO) as "bio-based solvents" was implemented. The lipophilic extracts of the leaves before and after hydrodistillation showed triterpenic acids (betulonic, oleanolic, betulinic and ursolic acids) as the main components. The content of these acids ranged from 30.6 to 37.1 g kgˉ¹ of the total content of the identified compounds. Ursolic acid was the main constituent, accounting for 47–51% of the total compounds content identified. The toxicity of the extracts on different cell lines representative of the innate immune system, skin, liver and intestine was also evaluated. Extraction of triterpenic acids with EO and CO proved to be efficient, with extraction yields of 2.8 and 2.7%, respectively. Ursolic acid was the major compound extracted, with a content of ≈18 g kgˉ¹ of dry biomass weight. The crude extracts of EO and CO were evaluated for their cytotoxicity and anti-inflammatory activity. CO crude extract showed less toxicity than the EO crude extract (nontoxic concentrations of 0.08 and 0.04 mg mLˉ¹ of extract, respectively). EO and CO crude extracts reduced nitrite production by 25.95 and 35.07%, respectively, and demonstrated higher anti-inflammatory activity than the corresponding triterpenic acids mixture. Regarding A. dealbata, the detailed chemical characterization of the bark, wood and leaves was performed. Lipophilic extracts of the bark and leaves showed terpenic compounds (namely lupenone and lupenyl acetate) as the main family of identified compounds (50 and 68% of total content, respectively). Wood extract showed sterols (namely spinasterol and dihydrospinasterol) as the main family of identified components (≈61%). Other families of compounds were also identified, namely, fatty acids, long-chain aliphatic alcohols, monoglycerides, and aromatic compounds. The lipophilic extracts of A. dealbata showed low or no cytotoxicity on different cell lines, representative of different tissues and organs (brain, innate immune system, skin, lung and liver). The polar extracts of the E. globulus (in ethanol, methanol, ethanol:water and methanol:water solvent) and A dealbata (in methanol:water) residues were obtained after removing the lipophilic fraction. The methanol:water extract of E. globulus leaves demonstrated a TPC and PC of 339.4 mg GAE gˉ¹ of extract and 5.7 mg PAC gˉ¹ of extract, respectively. The methanol:water extract of A. dealbata bark was the extract with the highest TPC and PC (565.2 mg GAE gˉ¹ of extract and 64.4 mg PAC gˉ¹ of extract, respectively), followed by the leaves (333.2 mg GAE gˉ¹ of extract and 21.3 mg PAC gˉ¹ of extract) and the wood (171.5 mg GAE gˉ¹1 of extract and 19.1 mg PAC gˉ¹ of extract). The antioxidant activity was evaluated using the 2,2-diphenyl-1-picrylhydrazyl (DPPH) and 2,2'-azinobis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid (ABTS) free radicals scavenging assays. In agreement with TPC and PC, the methanol:water extract showed the most promising activity (IC50 of 9.4 and 5.5 μg mLˉ¹ of extract for DPPH and ABTS, respectively). While the bark extract showed the best antioxidant activity (IC50 of 7.3 and 3.1 μg mLˉ¹ of extract for DPPH and ABTS, respectively). The scientific knowledge presented in this thesis, both from a chemical and biologically active point of view, contributes to the declassification of residues, waste reduction and promotes the status of useful by-products with various applications in the pharmaceutical, cosmetic and food industries.

Atualmente, há um crescente interesse na exploração de sub-produtos de biomassa agroflorestal como fonte de compostos com propriedades biológicas e nutracêuticas, tornando-os adequados para serem utilizados numa vasta gama de aplicações de valor acrescentado, tais como nos setores farmacêutico, cosmético e/ou alimentar. A recuperação destes compostos pode ser conjugada com um dos sectores mais importantes na economia Portuguesa, que é a exploração industrial e agro-florestal de Eucalyptus globulus associada à produção de pasta e papel que gera elevadas quantidades de biomassa residual. Além disso, existem espécies invasoras, tais como a Acacia dealbata, que também são consideradas como resíduos de biomassa durante a gestão florestal. Como tal, a caracterização detalhada das frações extrativas de biomassa residual, o desenvolvimento de processos de extração sustentáveis e a avaliação das suas atividades biológicas podem levar ao desenvolvimento de novas aplicações de valor acrescentado e contribuir para a rentabilidade do sector. Neste estudo, as frações lipofílicas das folhas de E. globulus e da casca, madeira e folhas de A. dealbata foram caracterizadas em detalhe por cromatografia em fase gasosa acoplada à espectrometria de massa (GC–MS), e o potencial bioativo dos extratos foi avaliado a fim de prever novas vias para a sua valorização. As frações polares também foram estudadas em termos de teores de fenóis totais (TPC) e proantocianidinas (PC) e potencial antioxidante. Numa estratégia que visava desenvolver um processo integrado para a exploração de óleos essenciais e ácidos triterpénicos de folhas de eucalipto, esta última fração foi analisada antes e depois da hidrodestilação, e a sua extração com óleos essenciais (EO) e 1,8-cineole (CO) como "solventes de base biológica" foi implementada. Os extratos lipofílicos das folhas antes e após hidrodestilação apresentaram como principais componentes os ácidos triterpénicos (ácidos betulónico, oleanólico, betulínico e ursólico). O conteúdo destes ácidos variou entre 30,6 a 37,1 g kgˉ¹ do conteúdo total de compostos identificados. O ácido ursólico foi o principal constituinte, representando 47–51% do conteúdo total de compostos identificados. Foi ainda avaliada a toxicidade dos extratos em diferentes linhas celulares representativas do sistema imunitário inato, pele, fígado e intestino. extração de ácidos triterpénicos com óleo essencial (EO) e 1,8-cineole (CO) demonstrou ser eficiente, com rendimentos de extração de 2,8 (EO) e 2,7% (CO). O ácido ursólico, foi o principal composto extraído, com um teor de ≈18 g kgˉ¹ de biomassa seca. Os extratos brutos de EO e CO foram avaliados quanto à sua citotoxicidade e atividade anti-inflamatória. O extrato bruto de CO mostrou menos toxicidade do que o extrato bruto de EO (concentrações não tóxicas de 0,08 e 0,04 mg mLˉ¹ de extrato, respetivamente). Os extratos brutos de EO e CO reduziram a produção de nitritos em 25,95 e 35,07%, respetivamente, e demonstraram uma maior atividade anti-inflamatória do que a mistura correspondente de ácidos triterpénicos. Relativamente à A. dealbata, foi realizada a caracterização química detalhada da casca, madeira e folhas. Extratos lipofílicos da casca e das folhas apresentaram compostos terpénicos (nomeadamente lupenona e acetato de lupenilo) como principal família de compostos identificados (50 e 68% do conteúdo total, respetivamente). O extrato da madeira apresentou esteróis (nomeadamente spinasterol e di-hidrospinasterol) como a principal família de componentes identificada (≈61%). Foram também identificadas outras famílias de compostos, nomeadamente, ácidos gordos, álcoois alifáticos de cadeia longa, monoglicerídeos e compostos aromáticos. Os extratos lipofílicos de A. dealbata mostraram baixa ou nenhuma citotoxicidade nas diferentes linhas celulares, representativas de diferentes tecidos e órgãos (cérebro, sistema imunitário inato, pele, pulmão e fígado). Os extratos polaresde E. globulus (nos solventes de etanol, metanol, etanol:água e metanol: água) e A dealbata (em metanol:água) foram obtidos após a remoção da fração lipofílica. O extrato de metanol:água das folhas de E. globulus demonstrou um TPC e PC de 339,4 mg GAE gˉ¹ de extrato e 5,7 mg PAC gˉ¹ de extrato, respetivamente. O extrato de metanol: água da casca de A. dealbata foi o extrato com maior TPC e PC (565,2 mg GAE gˉ¹ de extrato e 64,4 mg PAC gˉ¹ de extrato, respetivamente), seguido pelas folhas (333,2 mg GAE gˉ¹ de extrato e 21,3 mg PAC gˉ¹ de extrato) e pela madeira (171,5 mg GAE gˉ¹ de extrato e 19,1 mg PAC gˉ¹ de extrato). A atividade antioxidante foi avaliada através dos ensaios de captação dos radicais livres 2,2-difenil-1-picril-hidrazilo (DPPH) e 2,2’-azinobis(3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico (ABTS). Em concordância com o TPC e PC, o extrato de metanol:água apresentou atividade mais promissora (IC50 de 9,4 e 5.5 μg mLˉ¹ de extrato para o DPPH e para o ABTS, respetivamente). Enquanto, o extrato da casca foi o que apresentou melhor atividade antioxidante (IC50 de 7,3 e de 3.1 μg mLˉ¹ de extrato para o DPPH e para o ABTS, respetivamente). O conhecimento científico divulgado nesta tese, quer do ponto de vista químico, como biológico, contribui para a desclassificação de resíduos, diminuição do desperdício e promove o estatuto de subprodutos úteis com várias aplicações na indústria farmacêutica, cosmética e alimentar.