Induced pluripotent stem cells: based cancer immunotherapy

Abstract

Cancer is still one of the leading causes of death worldwide, mainly due to its resistance to current treatments. Recent studies have shown that embryonic stem cells (ESC) and tumor cells share some characteristics such as similar antigens, angiogenic growth factors and also lead to cell apoptosis. These findings suggest that ESC can be used as immunizing factors to promote antitumor responses. In this work, TNGA cells were used, a mouse embryonic stem cell (mESC) cell line, which were subjected to different culture conditions in order to try to obtain ground and primed pluripotency states. For this, three fundamental pluripotency factors, LIF and two inhibitors, PD and CHIR, were used. Initially, the objective was to evaluate the morphology of cells when subjected to different stimuli, and it was verified that, when subjected to medium with LIF and 2i, the cells reached a ground state of pluripotency and, when the 2i was removed, the cells reverted to a primed state of differentiation. In addition to this evaluation, 7 different genes were analyzed by RT-qPCR which, in previous RNA-seq analyses, showed to be more expressed when cells started differentiating processes and, therefore, may have relevance as possible new tumor antigens. The results confirmed that all genes have a higher expression under LIF conditions. Western-Blot assays were also performed to assess the expression of Nanog, a pluripotency marker, in cells under different conditions, verifying that its expression is increased under pluripotency stimuli (LIF/2i). To complement these results, transfection assays were carried out on some of the genes analyzed, to see if they certainly have any influence in promoting cell differentiation, and for the c-Myc gene silencing, the results showed an increase in the number of cells that reversed differentiation processes. A proteomics analysis was also performed comparing the breast cancer cell line, E0771, to TNGA cells in different culture conditions, although the results were not conclusive, there was verified a tendency towards the similarity between the patterns of primed TNGA cells and the tumor cell line. Some of the results obtained confirmed the existing bibliography, being promising for this study area but, however it is necessary to repeat some assays and carry out additional studies to understand if these tested genes are safe and if they can promote an immune response in an organism.

O cancro continua a ser uma das principais causas de morte em todo o mundo, principalmente devido à resistência adquirida aos tratamentos atualmente implementados. Estudos recentes demonstraram que as células estaminais embrionárias (ESC) e as células tumorais partilham algumas características, como antigénios semelhantes ou fatores de crescimento angiogénico. Estas descobertas sugerem que as ESC podem ser utilizadas como fatores de imunização para a promoção de respostas antitumorais. Neste trabalho foram utilizadas células TNGA, que são uma linha celular de células estaminais embrionárias de ratinho (mESC), que foram sujeitas a diferentes condições de cultura de forma a tentar obter estados ground e primed de pluripotência. Para isso foram utilizados três fatores de pluripotência fundamentais, LIF e dois inibidores, PD e CHIR. Inicialmente o objetivo foi avaliar a morfologia das células quando submetidas a estímulos diferentes, e verificou-se que, permanecendo em meio com LIF e 2i as células alcançavam um estado ground de pluripotência e, quando se retirava o 2i, as células revertiam para um estado primed de diferenciação. De seguida, foram analisados 7 genes diferentes por RT-qPCR que, em análises de RNA-seq anteriores, demonstraram estar mais expressos quando as células iniciavam processos de diferenciação, podendo, por isso, ter relevância como possíveis novos antigénios tumorais. Os resultados confirmaram que todos os genes têm uma maior expressão nas condições LIF. Foram também realizados ensaios de Western-Blot para avaliar a expressão de Nanog, um marcador de pluripotência, e validou-se que a sua expressão é aumentada nas condições de pluripotência, LIF/2i. Para complementar estes resultados, foram feitos ensaios de transfeção de alguns dos genes testados, para perceber se têm, realmente, alguma influência na promoção da diferenciação das células, sendo que, para o silenciamento do gene c-Myc, os resultados demonstraram um aumento no número de células que reverteram processos de diferenciação. Fez-se ainda uma análise de proteómica onde se comparou a linha celular de cancro da mama, E0771, às células TNGA em diferentes condições de cultura, apesar dos resultados não terem sido conclusivos, verificou-se uma tendência para a similaridade entre os padrões dos estados primed e da linha tumoral. Alguns dos resultados obtidos confirmaram a bibliografia existente, sendo promissores para esta área de investigação, contudo é necessário repetir os ensaios e fazer estudos complementares para perceber se estes genes são seguros e se conseguem promover uma resposta imune num organismo.