Comparison of two extracellular vesicles isolation methodologies from gastric cancer cells for STn detection

Abstract

Gastric cancer is the 5th most common and the 3rd deadliest cancer in Portugal. The search for biomarkers and clinical approaches to improve patients’ diagnosis and stratification through less invasive and more sensitive methods is an active research topic. Overexpression of the truncated O-glycan sialyl-Tn (STn) is commonly identified in gastric carcinoma tissue, which has been correlated with poor prognosis of gastric cancer patients. In addition, cancer cells secrete high levels of extracellular vesicles (EVs) into circulation, which cargo reflects the changes occurring in the cell of origin, and therefore, represent a valuable source for biomarker discovery and detection. The aims of this study were to compare the yield and purity of two different EV isolation methodologies, the ultracentrifugation (UC) and the UC combined with size exclusion chromatography (SEC) and to access the presence and detection of STn at EV membrane. EVs were isolated from two glycoengineered cell lines that synthetize different levels of STn and two control gastric cancer cell lines negative for this glycan by UC and UC+SEC. Isolated EVs were characterized through nanoparticle tracking analysis, transmission electron microscopy and western blotting, according to the International Society of Extracellular Vesicles. The detection of STn at EV membranes was assessed using an immunogold labeling technique. Furthermore, the impact of STn in EV uptake was studied using an indirect co-culture system. UC- and UC+SEC-EV isolates were compared regarding yield and purity through the analysis of EV concentration, presence of protein contaminants and EV markers such as alix, syntenin-1, Hsp70 and CD9. Results showed that UC+SEC isolated EVs with a lower yield but higher purity, facilitating the detection of both EV markers and STn. It was also possible to observe that cells expressing STn showed to secrete more EVs and that the STn seemed to be selectively packaged in EVs. Remarkably, we were able to detect STn at the membrane of EVs secreted by gastric cancer cells. Finally, we observed a different uptake capacity of the EVs positive and negative for STn by the recipient cells. In conclusion, our results showed that the combination of UC with SEC led to purer EVs, which facilitated the STn detection. Additionally, STn was highly expressed in EVs compared to the secreting cells and it was present at the EV membrane, highlighting its potential use as EV biomarker in gastric cancer. In the same line of evidence, cells that express STn secreted more EVs, which may facilitate its detection in the clinical context. Finally, the presence of STn in EVs affected its internalization by recipient cells, suggesting a role during cancer progression.

O cancro gástrico é o 5º tipo de cancro mais comum e a 3ª causa de morte relacionada com cancro, em Portugal. A pesquisa de novos biomarcadores e práticas clínicas para melhorar o diagnóstico e a estratificação dos pacientes através de técnicas menos invasivas e mais sensíveis é um tópico de investigação intensivo. A elevada expressão do O-glicano truncado sialil-Tn (STn) é frequentemente identificado em tecido de carcinoma gástrico e encontra-se relacionada com um pior prognóstico dos doentes. Adicionalmente, as células cancerígenas secretam níveis elevados de vesículas extracelulares (EVs) para a circulação, cuja carga reflete as alterações que ocorrem nas células de origem, representando uma fonte valiosa para a descoberta e deteção de biomarcadores. Os objetivos deste estudo foram comparar o rendimento e pureza das EVs obtidas por dois métodos de isolamento, a ultracentrifugação diferencial (UC) e a combinação de UC com cromatografia por exclusão de tamanho (SEC) e detetar a presença de STn na membrana das EVs. As EVs foram isoladas de duas linhas celulares geneticamente alteradas para expressarem níveis diferentes de STn e de duas linhas de células controlo de cancro gástrico por UC e UC+SEC. As EVs isoladas foram caracterizadas por nanoparticle tracking analysis, microscopia eletrónica de transmissão e western blotting, de acordo com a Sociedade Internacional de Vesículas Extracelulares. A deteção de STn na membrana das EVs foi aferida através de uma técnica de marcação com partículas de ouro. O impacto do STn na internalização de EVs foi estudado usando um sistema indireto de co-cultura. O rendimento e pureza das EVs isoladas por UC e UC+SEC foi comparado através da análise da sua concentração, da presença de contaminantes proteicos e de marcadores de EVs como a alix, sintenina-1, Hsp70 e CD9. O protocolo UC+SEC permitiu um menor rendimento, mas uma maior pureza das EVs isoladas, facilitando a deteção de marcadores de EVs e de STn. Foi ainda possível observar que as células que expressam STn secretam mais EVs e que o STn parece ser incorporado seletivamente nas EVs. De realçar que foi possível detetar STn na membrana de EVs secretadas por células de cancro gástrico. Por fim, observamos uma capacidade diferente das células recetoras em internalizarem EVs positivas ou negativas para STn. Em conclusão, os nossos resultados mostram que a combinação de UC com SEC levou à recuperação de EVs mais puras, facilitando a deteção de STn. Adicionalmente, o STn foi detetado em níveis mais elevados nas EVs do que nas células secretoras e encontrado na membrana das EVs, destacando o seu potencial uso como biomarcador em EVs de cancro gástrico. Na mesma linha de evidência, as células que expressam STn secretaram mais EVs, o que pode facilitar a sua deteção num contexto clínico. Por fim, a presença de STn nas EVs afetou a sua internalização em células recetoras, sugerindo um possível envolvimento durante a progressão do cancro.