Mutantes de cardosinas para o estudo do Plant Specific Insert: obtenção de construções e sua expressão em nicotiana tabacum

Abstract

A cardosina A e a cardosina B são duas proteinases aspárticas encontradas nos pistilos de cardo (Cynara cardunculus, L.). Apesar da sua elevada similaridade são expressas em diferentes tecidos, seguindo padrões temporais próprios e apresentam uma acumulação intracelular bastante diferente: a cardosina A é acumulada no vacúolo enquanto que a cardosina B é secretada. À semelhança de outras proteinases aspárticas vegetais, apresentam um segmento específico denominado PSI (Plant Specific Insert). Este domínio tem sido implicado no endereçamento vacuolar de proteinases aspárticas, quer pela sua acção como sinal de endereçamento, quer pela sua capacidade de interagir com membranas funcionando como um pré-requisito para o endereçamento vacuolar. Com o objectivo de contribuir para descortinar o verdadeiro papel deste domínio no endereçamento e processamento destas cardosinas, recorreu-se a técnicas de PCR para a obtenção de construções mutantes de cardosinas A e B, entre as quais se efectuou a troca do segmento PSI. Paralelamente, através do uso de técnicas de mutagénese dirigida, efectuou-se a construção de cardosinas A e B mutadas nos nucleótidos dos potenciais locais de clivagem deste domínio, evitando assim a sua remoção ao longo do processamento das cardosinas. Os resultados obtidos não permitiram uma conclusão clara sobre o papel do segmento PSI nas cardosinas A e B, uma vez que as construções testadas não revelaram alterações no direccionamento intracelular no sistema heterólogo Nicotiana tabacum. A possível aplicação destas construções em vários sistemas de expressão, assim como a importância destas construções para o estudo do papel desempenhado pelo PSI no endereçamento e processamento das cardosinas A e B é aqui discutida.

ABSTRACT: Cardosin A and cardosin B are two aspartic proteinases isolated from cardoon (Cynara cardunculus, L.) pistils. Despite presenting high similarity, they are expressed in different tissues, following different temporal patterns and accumulate in different compartments within the cell: cardosin A is transported and stored in vacuoles while cardosin B is secreted. A common feature of plant aspartic proteinases is the presence of a specific segment known as PSI (Plant Specific Insert). This domain has been implicated in vacuolar sorting of aspartic proteinases, acting as a sorting signal or through its capacity of membrane interaction, working as a pre-requisite for the vacuolar sorting. In order to uncover the real implication of this domain in cardosins processing and sorting, PCR techniques were used to obtain cardosins A and B mutants, in which the PSI domains were switched. In addition, techniques of site-directed mutagenesis were employed to the construction of mutants of cardosins A and B, in which the nucleotides of the potential cleavage sites of PSI were mutated, thereby preventing its removal during the processing steps of cardosins. The results obtained did not allow a clear conclusion about the biological role of PSI in cardosins, because the mutants tested did not reveal a significant variation in the intracellular sorting, using Nicotiana tabacum as expression system. The possible application of these constructions in different expression systems, as well as the importance of these to the study of the implication of PSI in cardosin processing and sorting are here discussed.