Stress oxidativo e oxidação proteíca : caracterização estrutural da a-amilase

Abstract

A α-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (α-1,4-D-glucano glucanohidrolase, EC 3.2.1.1) catalisa a hidrólise das ligações α-1,4-glucosídicas em oligossacarídeos e polissacarídeos. A α-amilase humana é uma proteína secretora que é produzida tanto nas glândulas pancreáticas como salivares, constituindo uma porção significativa da saliva e desempenhando um papel importante na digestão inicial do amido, glicogénio e outros polissacarídeos. A oxidação catalisada por metais (MCO) das proteínas possui um papel importante durante o stress oxidativo. O objectivo principal da realização deste trabalho foi a caracterização e identificação das modificações sofridas pela α-amilase quando oxidada pelo peróxido de hidrogénio (10, 1 e 0,1mM) numa reacção catalisada por metais num sistema in vitro. A espectrometria de massa combinada com a cromatografia líquida foi usada para identificar as modificações sofridas por cada uma das α-amilases em estudo. Relativamente à actividade enzimática, após sujeito a processo oxidativo, a α-amilase de Bacillus amyloliquefaciens sofre menor perda de actividade enzimática do que a α-amilase salivar humana. Quando se utiliza uma concentração de H2O2 de 10mM observa-se uma maior diminuição da actividade enzimática para cada uma das α-amilases quando comparado com uma concentração de H2O2 de 1mM e 0,1mM. Quando comparamos os resultados das modificações sofridas por cada uma das α-amilases verificamos que a α-amilase salivar humana, quando sujeita a uma concentração de H2O2 de 10mM possui um menor número de resíduos modificados (23) quando comparada com a α-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (26). Para uma concentração de reagente de H2O2 de 1mM, a α-amilase salivar humana apresenta também um menor número de resíduos oxidados (26) ao fim de 4 horas quando comparado o número dos resíduos oxidados observados para a α-amilase de Bacillus amyloliquefaciens (44). Os resultados sugerem que o processo de oxidação na α-amilase de Bacillus amyloliquefaciens progride mais rapidamente do que na α-amilase humana. Isto apesar de a actividade do Bacillus amyloliquefaciens se manter, em termos relativos, mais elevada. O número de resíduos de cisteína é significativamente superior na α-amilase salivar humana, não existindo outras diferenças significativas que permitam justificar a diferença de resíduos oxidados observados. A observação da oxidação da cisteína na posição 399 aos 30 minutos pode justificar a perda mais rápida da actividade enzimática, observada no caso da α-amilase salivar humana. O número diferente de resíduos observados resíde muito provavelmente no facto de o processo oxidativo ser mais lento no caso da α-amilase salivar humana. Este facto pode ser justificado pela presença de inumeras pontes dissulfureto nesta proteína, o que a torna mais compacta e portanto o acesso do radical hidroxilo aos resíduos mais difícil. É importante notar que estes resíduos de cisteína se verificaram ser, em grande medida, resistentes ao processo oxidativo.

ABSTRACT: The α-amylase from Bacillus amyloliquefaciens (α-1,4-D-glucan glucanohidrolase, EC 3.2.1.1) catalyzes the hydrolysis of α-1,4-glucosidic links in oligosaccharides and polysaccharides. The human α-amylase is a secretory protein that is produced both in pancreatic and salivary gland, and is a significant constituent of saliva, playing an important role in the initial digestion of starch, glycogen and other polysaccharides. The oxidation catalyzed by metals (MCO) of the protein has an important role during oxidative stress. The main purpose of this work is the characterization and identification of α-amylase oxidative modifications by hydrogen peroxide catalyzed by metals in a system in vitro Fenton system. Mass spectrometry, combined with liquid chromatography, was used to identify the oxidative changes of each of the α-amylase under study. Regarding enzyme activity, after the oxidative process, the α-amylase from Bacillus amyloliquefaciens suffers less loss of enzyme activity than the human salivary α-amylase. When using a concentration of H2O2 of 10mM there is a greater decrease in enzyme activity for each of the α-amylase when compared to a concentration of 1mM and 0.1mM of H2O2. When comparing the results of the changes of each of the α-amylases we found that the human salivary α-amylase, when subjected to a concentration of 10mM of H2O2.has a smaller number of modified residues (23) when compared with α-amylase of Bacillus amyloliquefaciens (26). For a concentration of 1 mM of H2O2.the human salivary α-amylase also has a smaller number of oxidized residues (26) after 4 hours of oxidation when compared the number of oxidized residues observed for α-amylase from Bacillus amyloliquefaciens (44). The results suggest that the oxidation process in α-amylase from Bacillus amyloliquefaciens progresses more rapidly than in human salivary α-amylase. This occurs despite the fact that the activity of Bacillus amyloliquefaciens remains relatively higher. The number of cysteine residues is significantly higher in human salivary α-amylase and no other significant differences justify the difference observed in the number of oxidized residues. The observation of oxidation of cysteine at position 399 at 30 minutes, observed for the human salivary α-amylase, can justify the faster loss of enzyme activity. The different number of residues observed is very likely to be the result of the slower oxidative process in the case of human salivary α-amylase. This can be justified by the presence of numerous disulfide bridges in this protein, which makes it more compact and therefore the access of the hydroxyl radical to the amino acid residues is more difficult. It is important to note that these cysteine residues were found to be very resistant to the oxidative process.