Understanding pathogenicity of Botryosphaeriaceae: focus on the secretome

Abstract

Species of the family Botryosphaeriaceae are important fungal pathogens causing numerous diseases on many woody plants, which ultimately may result in death of the host. Some fungi in this family are also human opportunist pathogens. Despite the relevance of these pathogens the mechanism of interaction between them and their hosts is still poorly known. Since the extracellular molecules secreted by fungi are the main effectors of fungus-plant interactions, this investigation was mainly centred on Botryosphaeriaceae secretome. The forecasted environmental temperature increase will lead to unknown effects on these pathogens. In order to shed light into the molecular mechanisms of toxicity/pathogenicity of Botryosphaeriaceae fungi under increasing temperatures, phytotoxicity and cytotoxicity of the culture filtrates of five Botryosphaeriaceae species were evaluated on detached tomato leaves and on mammalian cell lines (Vero cells and 3T3 cells). Data shows that temperature modulates the cyto- and phytotoxicity of Botryosphaeriaceae fungi. In general, 25 ºC benefits phytotoxicity while 37 ºC facilitates cytotoxicity to animal cells. The first comprehensive characterization of the in vitro secretome of Neofusiccocum parvum was made. LC-MS was used to identify N. parvum protein profile in the absence and presence of Eucalyptus stem and this resulted in the consistent identification of over one hundred proteins diffrentially expressed involved in adhesion and penetration of pathogen to host tissues, plant and fungal cell wall degradation, pathogenesis, reactive oxygen species (ROS) generation, proteolytic processes. Also fungal effectors and fungal toxin. Identified proteins were induced mostly under host mimicry secretome, especially cell wall degrading enzymes (CWDEs) (targeting pectin and hemicellulose) which are involved in plant invasion. Neofusicoccum parvum aggressiveness could be explained by a synergistic activity of extracellular CWDE, particularly of glycoside hydrolases and polysaccharide lyases, that may be involved in plant host colonization. The extracellular protein profile of N. parvum suggest that the fungus has adjusted its secretome to the host cell wall chemical properties, which agrees with the fact that N. parvum being a phytopathogen. Likewise, absence of lignin degrading enzymes and existence of several cellulase and hemicellulase enzymes fits well with its endophytic lifestyle. In addition, the presence of pectin-degrading enzymes in the secretome of N. parvum even in the absence of host material, indicating that this fungus is more adapted to degrade intact or living plants than decaying biomass, which implies that the fungus is likely to be a latent pathogen. Overall, our results suggest that N. parvum has a hemibiotrophic lifestyle by the secretion of proteins putatively involved in plant cell wall degradation and concurrently masking or modifying its own cell wall , allowing the fungus to colonize the host plant (biotrophic), while actively releasing enzymes and toxins (necrotrophic). Furthermore, cloning and characterization of four genes encoding putative necrosis and ethylene inducing proteins (NLPs) from N. parvum was carried out. Four NLP genes were successfully cloned and expressed in E. coli. Pure recombinant NprvNep proteins were toxic both to plant (detached tomato leaves) and mammalian cells (Vero cells) in a dose-dependent manner. NLP genes in N. parvum are functional genes encoding proteins toxic both to plant and mammalian cells, being most probably involved in virulence or cell death during infection by N. parvum. This study provides additional insight into the pathogenicity mechanism of N. parvum and subsequently of members of the Botryosphaeriaceae family

Várias espécies da família Botryosphaeriaceae são agentes patogénicos importantes, causando doenças em plantas lenhosas que originam, por vezes, a sua morte. Alguns destes fungos são também oportunistas de humanos. No entanto, e apesar da relevância destes organismos como agentes patogénicos, os mecanismos de interação com os seus hospedeiros são ainda pouco conhecidos. Tendo em conta que as moléculas extracelulares são os efectores principais da interação fungo-planta, esta investigação centra-se essencialmente no secretoma dos fungos da família Botryosphaeriaceae. Espera-se que o aumento previsto da temperatura ambiental tenha efeitos, ainda desconhecidos, no comportamento destes agentes patogénicos. De modo a elucidar os mecanismos moleculares de toxicidade/patogenicidade dos fungos desta família, quando sujeitos a temperaturas crescentes, estudou-se a fito e citotoxicidades destes organismos. Foram analisados os meios extracelulares de cinco espécies, recorrendo-se a ensaios em folhas de tomateiros e em linhas celulares de mamíferos. Os dados mostram que a temperatura modula a cito- e fitotoxicidade das espécies de Botryosphaeriaceae estudadas. Globalmente, a temperatura de 25 ºC beneficia a fitotoxicidade enquanto que a temperatura de 37 ºC facilita a toxicidade para células animais. O secretoma de uma espécie – Neofusiccocum parvum – foi caracterizado mais profundamente. O perfil de proteínas extracelulares desta espécie na presença de ramos de eucalipto foi caracterizado por LC-MS e comparado com o secretoma controlo, tendo sido identificadas mais de uma centena de proteínas diferencialmente expressas. Estas proteínas estão envolvidas na adesão e penetração do fungo nos tecidos do hospedeiro, na degradação das paredes celulares vegetais e das do próprio fungo, em mecanismos de patogénese, na produção de radicais livres de oxigénio e em proteólise. Foram também identificados fitotoxinas e efetores fúngicos. A maioria das proteínas identificada foi expressa na presença do hospedeiro, nomeadamente enzimas que degradam componentes da parede vegetal (CWDE) como a pectina e hemicelulose e que estão envolvidas no processo de invasão do hospedeiro. A conhecida patogenicidade de N. parvum poderá ser explicada por uma ação concertada da atividade de CWDEs, particularmente de glicosil hidrolases e de liases de polissacarídeos. O perfil de proteínas extracelulares de N. parvum sugere que este fungo ajusta a expressão do secretoma às propriedades químicas das paredes vegetais, em concordância com o fato deste ser um importante fitopatogénio. Do mesmo modo, a ausência de enzimas de degradação da lenhina e a presença de várias enzimas que degradam celulose e hemicelulose coadunam-se com um estilo de vida endofítico. Adicionalmente, a presença no secretoma de N. parvum de enzimas capazes de degradar pectina, mesmo na ausência de material vegetal, indica que este fungo estará mais adaptado a degradar tecido vegetal vivo do que biomassa em decomposição de acordo com ser um patógeno latente. Estes resultados, sugerem que N. parvum possui um estilo de vida hemibiotrófico: secreta enzimas putativamente envolvidas na degradação das paredes vegetais simultaneamente modificando as suas próprias paredes, o que lhe permite colonizar o hospedeiro (biotrófico) enquanto ativamente secreta enzimas hidrolíticas e toxinas (necrotrófico). Adicionalmente foram clonados e caraterizados quatro genes que codificam “necrosis and ethylene inducing proteins” (NLPs). Os genes foram clonados com sucesso e expressos em E. coli. As proteínas NprvNep recombinantes mostraram ser tóxicas para plantas (folhas de tomateiro destacadas) e para células de mamífero (células Vero) de um modo dependente da dose. Os genes NLP genes em N. parvum são genes funcionais que codificam proteínas tóxicas tanto para tecidos vegetais como para células animais, estando potencialmente envolvidas na virulência e/ou na morte celular do hospedeiro durante a infeção. Este estudo revelou dados moleculares sobre a patogenicidade de N. parvum e consequentemente elucida a atuação de alguns membros da família Botryosphaeriaceae.