Zebrafish embryos as a biological model to study the effects of nanoplastics

Abstract

Plastic waste is currently recognized as a critical factor for environmental health. This environmental problem is aggravated by fact that plastics fragment to smaller and smaller particles, reaching nanometric dimensions, increasing their bioavailability and potentially their toxic effects. There are, however, few studies of nanoplastics effects (NPs, less than 100 nm plastic size reduction), especially in freshwater vertebrates. Thus, this work aimed to study the potential effect of nanoparticles of two different polymers, polystyrene (PS) and polymethylmethacrylate (PMMA), ~ 30 nm, in a range of concentration between 0.001 and 100 mg / L. In order to ensure that NPs has desirable characteristics (size, shape, different analysis methods have been tested for reproducibility of the final product).After synthesis, the NPs were purified using dialysis sleeves and characterized in ultrapure water, in terms of hydrodynamic size (using dynamic light scattering (DLS), size and morphology (using electron microscopy). Following characterization, experimental assays with zebrafish embryos that involved exposure to NPs (in single exposures and combined with an environmental pollutant with a wide distribution in aquatic systems, pyrene, four rings polycyclic aromatic hydrocarbon). In the NPs single assays, parameters such as developmental changes, swimming behaviour and stress response and biochemical responses associated with neurotransmission (cholinesterase - ChE), energy metabolism (glycogen - Gly, isocitrate dehydrogenase- IDH and lactate dehydrogenase - LDH) and antioxidant response (glutathione) were evaluated. S-transferase - GST, glutathione peroxidase - GPx and catalase - CAT) and oxidative damage (lipid peroxidation - LPO). In trials where embryos were subjected to combined exposure to NPs and pyrene, only developmental changes, swimming behaviour and stress response were evaluated. In general, it was found that under the experimental conditions tested, that NPs (round, average size ~30 nm) had no significant impact on mortality or embryo development. However, changes in larval swimming behaviour and biochemical parameters were observed. Thus, in organisms exposed to PS NPs, the total swim distance increased in organisms exposed to 0.001, 1 and 100 mg/L. In terms of PMMA NPs, total swim distance increased significantly in organisms exposed to 0.001, 0.01 and 1 mg/L. However, the swimming distance and time in outside of the test area (expressed as a percentage) decreased in the exposed organisms at 0.001 and 10 mg/L. In terms of biochemical responses, it was found that PS NPs could affect neurotransmission (causing increased cholinesterase activity at 1 mg/L concentration and decreased at 0.01.0.1 mg/L (PS NPs) and 0.01 mg/L (PMMA). In terms of parameters associated with the antioxidant response, PS inhibited GST (0.01,10 and 100 mg / L) and CAT (0.001 and 10 mg / L), while GPx was induced to (0.001 mg / L) and inhibited at (0.1 and 1 mg / L). PMMA induced GPx (10 mg / L), increased CAT activity (0.001, 0.1 and 10 mg / L). Also, CAT was decreased by PMMA at 0.01 mg/L. There was lipid peroxidation in the exposure by PS NPs (1 mg / L) and PMMA NPs (0.001, 0.01 and 0.1 mg / L). In terms of energy metabolism, IDH was found decreased in organisms exposed to PS NPs (0.001, 0.01, 0.1 and 100 mg / L) and an increase for PMMA (0.001 mg / L). Results of simultaneous exposure to NPs and pyrene disassembled that the effect of pyrene toxicity (pericardial oedema and tail curvature) (0.01 and 1 μg / L) decreased. In addition, the combination of NPs and pyrene also reduced the effect of NPs (0.1 and 100 mg / L) on zebrafish swimming behaviour of both polymers. Thus, it is demonstrated that short-term exposure to NPs may cause biochemical and behavioural changes that may compromise animal welfare and have environmental consequences (e.g. ability to acquire food, breeding and escape from predation). Zebrafish embryos demonstrated sensitivity to low concentrations of NPs, justifying their application in ecotoxicological studies of emerging contaminants.

O lixo plástico é atualmente reconhecido como fator crítico para a saúde ambiental. Este problema ambiental é agravado pelo fato de o plástico se ir degradando em partículas cada vez mais pequenas, atingindo dimensões nanométricas, o que aumenta a sua biodisponibilidade e potencialmente os seus efeitos tóxicos. Há, no entanto, poucos estudos sobre os efeitos nanoplásticos (NPs, definidos como partículas de plástico de tamanho inferior a 100 nm), principalmente em vertebrados de água doce. Assim, este trabalho teve como objetivo estudar o potencial efeito deletério de nanopartículas de dois polímeros diferentes, o poliestireno (PS) e polimetilmetacrilato (PMMA), com um tamanho aproximado de ~30 nm, numa gama de concentrações entre 0,001 e 100 mg/L. De forma a garantir que os NPs a testar apresentavam as características desejadas (e.g. tamanho e forma), diferentes metodologias de síntese foram testadas. Após a síntese, os NPs foram purificados com recurso a mangas de diálise, e caracterizados, em água ultra-pura, em termos de tamanho hidrodinâmico (com recurso a espalhamento de luz dinâmico (DLS), tamanho e morfologia (com recurso a microscopia eletrónica (SEM)). Após a caracterização, foram efetuados ensaios experimentais com embriões de peixe zebra que envolveram exposição a apenas NPs e exposições combinadas com um poluente ambiental com uma ampla distribuição em sistemas aquáticos, o pireno, hidrocarboneto aromático policíclico de quatro anéis aromáticos) Nos ensaios apenas com NPs foram avaliados parâmetros como alterações no desenvolvimento, comportamento natatório e resposta de stress; e respostas bioquímicas associadas a neurotransmissão (colinesterase - ChE), metabolismo energético (glicogénio, atividade da isocitrato desidrogenase – IDH e lactato desidrogenase - LDH), resposta antioxidante (glutationa S-transferase - GST, glutationa peroxidase – GPx e a catalase - CAT) e dano oxidativo (peroxidação lipídica). Nos ensaios em que os embriões foram sujeitos a exposição combinada a NPs e pireno, foram avaliadas apenas alterações no desenvolvimento, comportamento natatório e resposta de stress. De uma forma geral, verificou-se que nas condições experimentais testadas os NPs (redondos, de tamanho médio de 30 nm) não tiveram impacto significativo em termos de mortalidade nem em termos do desenvolvimento dos embriões. Contudo, foram observadas alterações no comportamento natatório das larvas e em parâmetros bioquímicos. Assim, nos organismos expostos a NPs PS, a distância total nadada aumentou nos organismos expostos a 0,001, 1 e 100 mg/L. Em termos de NPs PMMA, a distância total nadada aumentou significativamente nos organismos expostos a 0,001, 0,01 e 1 mg/L. No entanto, a distância nadada na zona externa da área de teste e o tempo passado nessa área (expresso em percentagem) diminuíram nos organismos expostas a 0,001 e 10 mg/L.Em termos de respostas bioquímicas, verificou-se que NPs PS têm a capacidade de afetar a neurotransmissão (aumentou a atividade da colinesterase na concentração 1 mg/L e diminuiu nas concentrações 0.01, 0.1 mg/L (PS NPs). Nos organismos expostos a PMMA NPs, foi igualmente observada inibição da colinesterase nos organismos expostos a 0.01 mg/L. Em termos de parâmetros associados à resposta antioxidante, NPs PS inibiram a GST (0.01,10 e 100 mg/L) e CAT (0.001 e 10 mg/L), enquanto que a GPx foi induzida (0.001 mg/L) e inibida (0.1 e 1 mg/L). Relativamente ao PMMA, verificou-se que os organismos expostos a estas partículas apresentaram uma indução da GPx (10 mg/L) e aumento da atividade da CAT (0.001, 0.1 e 10 mg/L) e, também se observou uma diminuição da sua atividade na condição 0.01 mg/L. Os dois polímeros demonstraram a capacidade de induzir peroxidação lipídica sendo esse efeito mais evidente para as partículas de PMMA (0.001, 0.01 e 0.1 mg/L) que PS NPs (1 mg/L). Em termos de metabolismo energético, verificou-se que a IDH foi inibida nos organismos expostos a NPs PS (0,001, 0,01, 0,1 e 100 mg/L) e um aumentou a sua atividade nos organismos expostos a NPs PMMA (0,001 mg / L). Os resultados da exposição simultânea a NPs e pireno desmontaram que o efeito de toxicidade (edema do pericárdio e curvatura da cauda) do pireno (0.01 e 1 μg/L) decresceu. Alem disso, a combinação NPs e pireno também reduziu o efeito dos NPs (0.1 e 100 mg/L) no comportamento dos dois polímeros. Assim, demonstra-se que a exposição de curta duração a NPs pode causar alterações a nível bioquímico e comportamental que podem comprometer o bem-estar animal e ter consequências a nível ambiental (e.g. capacidade de adquirir alimento e escapar a reprodutores). Os embriões de peixe zebra demonstraram grande sensibilidade a concentrações baixas de NPs, justificando a sua aplicação em estudos ecotoxicológicos de contaminantes emergentes.