Estudo da actividade pseudoperoxidativa da hemoglobina na degradação enzimática da bilirrubina: sua aplicação analítica e biomédica

Abstract

O objectivo desta tese de doutoramento foi o estudo de uma nova reacção enzimática para a degradação da bilirrubina, aproveitando a actividade pseudoenzimática da hemoglobina em presença de peróxido de hidrogénio. Em primeiro lugar pretende-se estudar aprofundadamente as diferentes variáveis que afectam esta reacção, com o objectivo de a caracterizar e desenhar um procedimento optimizado que permita a sua utilização em diferentes aplicações, tanto na área da química analítica como na biomedicina. Com esta intenção pretende-se desenhar um sistema automatizado para a determinação de bilirrubina baseado nesta reacção e em sistemas de fluxo contínuo que permitam uma gestão gdequada de fluidos. Pretende-se também estudar um processo de imobilização do sistema enzimático de modo a estabelecer a possiblidade de preparar membranas opticamente activas susceptíveis de serem incorporadas em transdutores ópticos para a obtenção de biossensores de bilirrubina. Neste caso pretende-se utilizar como suporte modelo o poli (álcool vinílico) como material mais representativo de um conjunto de polímeros que, reunem características apropriadas quanto a bio~om~atibilidade, hidrofilicidade, transparência, etc. As membranas obtidas serão caracterizadas e avaliadas aplicando diferentes técnicas físico-químicas, tanto em condições "batch" como de fluxo contínuo. Com este propósito desenharam-se os dispositivos adequados para a sua realização. Finalmente proceder-se-á ao estudo da possibilidade de utilizar esta reacão para o desenho de um reactor que permita a degradação da bilirrubina em contínuo num sistema extracorporal de aplicação no tratamento da icterícia em recém-nascidos. Neste caso pretende-se desenvolver um processo de imobilização dos diferentes componentes do sistema pseudoenzitnático que permita a sua incorporação como material de enchimento em reactores do tipo cromatográfico.

The aim of this work was to study a new enzymatic reaction for bilirubin degradation using the pseudoenzymatic activity of haemoglobin while present together with hydrogen peroxide. First of all different variables related to the .reaction were studied aiming to characterise and design an optirnised procedure to use with both analytical chemistry and biomedical purposes. Then, automatic systems for bilirubin determination based on both this reaction and continue flow systems were designed in order to achieve efficient management of biological fluids. The enzymatic system was also imrnobilised to prepare suitabfe membranes showing optical properties for being applied to optical transducer devices for future bilirubin biosensors. With this purpose poly(viny1 alcohol) was used as the most representative material of a class of polymers which gather the most suitable characteristics related to biocompatibility, hydrophilicity and transparency. A set of batch and flow experiments based on different physical and chemical methods, were established to accomplish the characterisation and evaluation of these membranes. Suitable devices and systems were designed and made: Finally we demonstrated that treatment of neonatal jaundice was possible using this highly specific enzymatic system. Artificial removal of bilirubin from blood is characterised by extracorporeal circulation and in this way we have to develop a new approach to immobilise the components of the enzymatic system providing good substrate accessibility and suited for use in chromatography-type columns.