Production and characterization of the fusion ZZapo-CBM64 for the capture and detection of apolipoprotein-A1 in paper tests

Abstract

Affibodies (ZZ) são pequenas proteínas de afinidade que podem ser modificadas para se ligarem a alvos específicos. Estas proteínas têm sido sugeridas como uma alternativa a anticorpos, devido ao seu processo de produção mais simples e barato. Assim, o objetivo deste trabalho de mestrado visou a possibilidade da utilização de um affibody (ZZapo) para a captura da Apolipoproteina-A1 (Apo-A1) e sua deteção com anticorpos Anti-Apo-A1 conjugados com Nanopartículas de Ouro (AuNPs) num Dispositivo Microfluídico Analítico de Papel (μPAD). Para atingir o objetivo proposto, a fusão de uma molécula com afinidade a carboidratos da família 64 (CBM64) com o affibody ZZapo (ZZapo-CBM64) foi desenhada, produzida em E.coli, sequenciada, purificada e quantificada com sucesso. A fusão ZZapo-CBM64 foi comparada com a fusão semelhante ZZ-CBM64, que tem afinidade para imunoglobulina G (IgG). Foi testada a capacidade de ligação das fusões à celulose, tendo-se verificado que ambas apresentaram alta afinidade a micropartículas e papel de celulose. Foi ainda testada a capacidade de ligação das duas fusões a IgG, pela utilização de IgG marcado com fluorescência. No entanto, ao contrário da ZZ-CBM64, a ZZapo-CBM64 não mostrou afinidade para a IgG. Um teste μPAD foi criado com barreiras impressas a cera hidrofóbica, e com um adesivo na base do teste, o que permitiu os testes serem feitos em superfícies planas e ainda contribuiu para um fluxo da amostra mais rápido. Os testes μPAD mostraram interações não específicas entre ZZapo-CBM64 e AuNPs, que foram removidas pela conjugação das AuNPs com Albumina de Soro Bovino (BSA) e adição de BSA e Tween20 à solução tampão. Os testes μPAD para deteção da Apo-A1 mostraram interações não específicas entre Apo-A1 e a membrana adesiva, que foram removidas pela utilização de um tampão de Bicarbonato de Amónia com BSA e Tween20. A deteção de Apo-A1 em μPADs não foi conseguida devido ao ZZapo-CBM64 não capturar a Apo-A1. Esta falha poderá ser devido a algum bloqueio da zona de captura relacionado com a estrutura 3D da fusão. De modo a ultrapassar esta questão, deverão ser realizados trabalhos futuros para o estudo da estrutura 3D da fusão, assim como estudo de outras fusões com diferentes variantes de affibodies para averiguar se o problema é exclusivo à fusão ZZapo-CBM64 ou não.

Affibodies (ZZ) are small affinity proteins that can be engineered to bind to specific targets. These molecules have emerged as an alternative to antibodies due to their simpler and cheaper production process. The objective of this work was thus to assess the possibility of using an affibody (ZZapo) to capture Apolipoprotein-A1 (Apo-A1) and its detection using Anti-Apo-A1 antibodies conjugated to Gold Nanoparticles (AuNPs) on a Microfluidic Paper-Based Analytical Device (μPAD). To achieve the proposed objective, a fusion of a Carbohydrate Binding Molecule of the family 64 (CBM64) with a ZZapo affibody (ZZapo-CBM64) was successfully designed, produced in E. coli, sequenced, purified and quantified. The ZZapo-CBM64 fusion was then compared to a similar ZZ-CBM64 fusion (produced and purified in the same way) with immunoglobulin G (IgG) binding capacity, and tested for its cellulose binding capacity. Both fusions showed high affinity to cellulose particles and paper. They were also tested for IgG binding capacity, using a fluorescently labelled IgG. While ZZ-CBM64 successfully captured IgG, the new ZZapo-CBM64 did not capture the labelled IgG. A μPAD test was designed and produced with wax printed hydrophobic barriers, and the use of an adhesive membrane in the bottom of the test enabled running tests on a flat surface, and contributed for faster sample flow. μPAD tests showed that ZZapo-CBM64 and AuNPs had non-specific interactions, which were removed by conjugating AuNPs with Bovine Serum Albumin (BSA) and using a buffer containing BSA and Tween20. μPAD tests for the detection of Apo-A1 showed non-specific binding of Apo-A1 and the adhesive membrane, which was removed by using ammonium bicarbonate buffer. Apo-A1 detection in μPADs was unsuccessful, which was shown to be caused by ZZapo-CBM64 failing to capture Apo-A1. This failed capture could be caused by the capture zone of the protein being blocked. Future works should be directed to the study of the 3D structure of this fusion, as well as the study of other fusions with different affibody variants to assess if this problem is exclusive to ZZapo-CBM64 or not.