WNT/ß-catenin and Hedgehog signaling pathways as therapeutic targets in B cell neoplasms

Abstract

As neoplasias de células B são caracterizadas por um grupo heterogéneo de doenças que incluem linfomas de células B e doenças de células plasmáticas, entre outras. O mieloma múltiplo (MM) é uma neoplasia maligna originada pela proliferação de células plasmáticas monoclonais que permanece incurável. Esta proliferação de células plasmáticas malignas no microambiente da medula óssea produz proteína monoclonal no sangue ou na urina e está associada a sinais malignos. Representa aproximadamente 1% das doenças neoplásicas e 10% a 15% das neoplasias hematológicas. O linfoma difuso de grandes células B (DLBCL) é a forma mais comum de linfoma não-Hodgkin, representando 31% dos linfomas não-Hodgkin, e sendo fatal se não for tratado. DLBCL é um linfoma agressivo e de crescimento rápido que pode surgir nos gânglios linfáticos ou fora do sistema linfático, no trato gastrointestinal, testículos, tiroide, pele, mama, osso ou cérebro. A ativação inadequada de vias de sinalização embrionárias, como WNT/β-catenina e Hedgehog, vias críticas de autorrenovação das células estaminais e diferenciação das células hematopoiéticas, tem sido implicada nestas neoplasias de células B. Neste sentido, essas vias podem constituir potenciais novos alvos terapêuticos para tratar o MM e o DLBCL. O objetivo principal deste estudo foi avaliar o potencial terapêutico de inibidores das vias WNT/β-catenina e Hedgehog, respetivamente IWR-1 e vismodegib, isolados e em combinação um com o outro, usando linhas celulares de MM e DLBCL. Para avaliar o efeito dos inibidores IWR-1 e vismodegib no MM e no DLBCL foram utilizadas linhas celulares H929 (MM) e FARAGE (DLBCL), submetidas a diferentes concentrações dos inibidores. A atividade metabólica foi avaliada utilizando o ensaio de resazurina, a morte celular por microscopia ótica (coloração de May-Grunwald) e citometria de fluxo (FC) (marcação com anexina V/7-AAD e quantificação de BCL-2 e caspases, proteínas relacionadas com a apoptose). A análise do ciclo celular foi avaliada por FC, utilizando a solução PI/RNAse. Também por FC, foi avaliada a expressão de β-catenina e ERK fosforilado, moléculas relacionadas com as vias de sinalização WNT/β-catenina e HH. Os resultados mostraram que IWR-1 e vismodegib reduziram a atividade metabólica celular de modo dependente do tempo, da linha celular e da concentração, em monoterapia ou em combinação. O IC50 do IWR-1 nas células H929 e Farage foi de 40 μM e 75 μM, respetivamente, enquanto que o IC50 do vismodegib foi de 70 μM para as células H929 e 57 μM para as células Farage, após 24 horas de tratamento. Estes resultados mostram que as células H929 são mais sensíveis ao IWR-1 e, contrariamente, as células Farage são mais sensíveis ao vismodegib. Estes compostos induzem a morte celular predominantemente por apoptose e induzem bloqueio do ciclo celular em G1. Em conclusão, os resultados sugerem que IWR-1 e vismodegib são potenciais novas terapias direcionadas que poderão ser eficientes no tratamento de MM e DLBCL. No entanto, IWR-1 é mais indicado para a terapêutica do MM e o vismodegib para a terapêutica do DLBCL.

B-cell neoplasms are characterized by a heterogeneous group of diseases that include, B-cell lymphomas and plasma cell disorders, among others. Multiple myeloma (MM) is a malignant neoplasm originated by proliferation of monoclonal plasma cells that remains incurable. This clonal proliferation of malignant plasma cells occurs in the bone marrow microenvironment, leads to the production of monoclonal protein in the blood or urine and is associated with malignant signals. It accounts for approximately 1% of neoplastic diseases and 10% to 15% of hematologic neoplasms. Diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) is the most common form of non-Hodgkin lymphoma, representing 31% of the non-Hodgkins lymphomas, being fatal if untreated. DLBCL is an aggressive, fast-growing lymphoma, that can arise in lymph nodes or outside of the lymphatic system, in the gastrointestinal tract, testicles, thyroid, skin, breast, bone, or brain. Inappropriate activation of conserved embryonic signaling pathways, such as WNT/β-catenin and Hedgehog (HH), critical for stem cell self-renewal and differentiation of hematopoietic cells, has been implicated in these B-cell neoplasms. In this sense, these pathways may constitute new potential therapeutic targets to treat MM and DLBCL. The main goal of this study was to evaluate the therapeutic potential of a WNT/ β-catenin and a Hedgehog inhibitor, respectively, the IWR-1 and vismodegib, alone and in combination, using MM and DLBCL cell lines. To evaluate the effect of IWR-1 and vismodegib in MM and in DLBCL, H929 (MM) and FARAGE (DLBCL) cell lines were submitted to different concentrations of the inhibitors. Metabolic activity was evaluated using resazurin assay and cell death was evaluated by optical microscopy (May-Grunwald staining) and flow cytometry (FC) (Annexin V/7-AAD staining and by quantification of BCL-2 and caspases expression, apoptosis-related proteins). Cell cycle analysis was evaluated by FC, using a PI/RNAse solution. Also by FC the expression of β-catenin and phosphorylated ERK, molecules related to the WNT/β-catenin and HH signaling pathways, were tested. Results showed that IWR-1 and vismodegib reduced cell metabolic activity in a time-, cell line- and dose-dependent manner, when administrated in monotherapy or in combination. The IC50 of IWR-1 in H929 and Farage cells was 40 μM and 75 μM, respectively, and the IC50 of vismodegib was 70 μM for H929 cells and 57 μM in Farage cells, after 24h of treatment. These results show that H929 cells are more sensitive to IWR-1 and, contrarily, Farage cells are more sensitive to vismodegib. These compounds induce cell death mainly by apoptosis and showed an arrest in cell cycle at G1. In conclusion, results suggest that IWR-1 and vismodegib are potential new targeted therapies that could be efficient in MM and DLBCL treatment in the future. However, IWR-1 is more indicated for MM therapy and vismodegib for DLBCL therapy