Perfusion bioreactor for the high-throughput analysis of combinations of biomaterials/stem cells

Abstract

A engenharia de tecidos combina células humanos, materiais e engenharia de modo a induzir respostas biológicas com o objetivo de proporcionar uma regeneração rápida e correta do tecido danificado. O uso de matrizes tridimensionais (3D) para suportar o crescimento celular, ao contrário dos convencionais materiais 2D, é de grande importância para a simulação da organização estrutural de tecidos biológicos. Outros aspetos da matriz extracelular (ECM), para além da sua arquitetura são conhecidos por afetar a resposta celular. Fatores biomecânicos apresentados às células através das proteínas da ECM influenciam a adesão celular e fenómenos tais como manutenção do fenótipo, diferenciação celular e proliferação. Estudos in vitro muitas vezes falham na apresentação de fatores fisiológicos que incluem dinâmica de fluidos, o qual pode levar a uma correta oxigenação do biomaterial com células incorporadas, bem como a fenómenos de mecanotransdução. Neste trabalho, propomos um sistema que revela o efeito de 32 combinações de proteínas da ECM na adesão e expressão da alcalina fosfatasse (ALP) em células estaminais derivadas da coluna óssea (MSCs), tanto em ambiente estático como dinâmico. Um bioreator foi desenhado de modo a permitir um estudo high-throughput, para que fossem analisadas 32 combinações biomaterial-célula simultaneamente. Este bioreactor foi construído a partir de material de laboratório comum e de baixo custo (incluindo tubos e seringas descartáveis). As MSCs foram semeadas em scaffolds de quitosano poroso, modificado covalentemente com proteínas da ECM do osso, assim como proteínas responsáveis por contacto célula-célula e componentes do esmalte. Uma análise fatorial permitiu correlacionar a presença das várias combinações proteicas com melhor adesão celular ao biomaterial, assim como uma expressão de ALP após 24 horas e 5 dias de cultura. Os dados foram analisados tanto para ambiente estático, como dinâmico na presença de um pequeno fluxo, previamente comprovado como potenciador da diferenciação osteogénica de MSCs. O sistema desenvolvido foi útil na interpretação da grande complexidade das interações célula-ECM, e poderá ter possível aplicação no desenvolvimento de biomateriais para regeneração óssea, bem como em futuras aplicações como modelos de doença.

Tissue engineering combines human cells, materials and engineering to induce biological responses seeking the rapid and accurate healing of damaged tissues. The use of three-dimensional (3D) matrices to support cellular growth, in opposition to traditionally used two dimensional (2D) materials, are of utmost importance to emulate the structural organization of biological tissues. Other aspects of the extracellular matrix (ECM) beyond its architecture are known to affect cell response. The biochemical cues presented to cells by ECM proteins influence cell adhesion and phenomena as cell phenotype maintenance, cell differentiation and proliferation. In vitro studies often lack physiological-like cues that include slow fluid dynamics, which may impair the correct oxygenation of the biomaterial-cells construct. Here, we engineered a system to disclose the effect of 32 different ECM protein combinations on the adhesion and alkaline phosphatase (ALP) expression of bone marrow-derived mesenchymal stem cells (MSCs), both under static and flow perfusion conditions. A novel bioreactor was designed to enable a high-throughput study, that allowed to withdraw data from 32 biomaterial-cell combinations in one single test. The bioreactor was assembled from widely available affordable labware (including plastic tubes and disposable syringes). MSCs were seeded on chitosan porous scaffolds covalently modified with bone ECM proteins, as well as cell-cell contact proteins and enamel components. A factorial analysis study allowed correlating the presence of single and combinations of proteins with improved cell adhesion to biomaterials, as well as improved ALP quantification after 24 hours and 5 days of culture. The data was analyzed both for static culture conditions, as well as in the presence of a slow perfusion rate, previously shown to potentiate MSCs osteogenic differentiation. The developed system has proven to be useful in the interpretation of the wide complexity of cells-ECM interactions, and may find application in the development of biomaterials for tissue regeneration or as disease model platforms.